内容提要
本研究开发了一种近红外探针PBQI，它对极性和（ONOO-） 的波动高度敏感且能做出响应。PBQI可靶向线粒体和脂滴，实现对细胞焦亡相关的亚细胞变化的实时追踪。研究发现，在顺铂和二甲双胍引发的细胞焦亡过程中，PBQI 能够区分正常细胞和癌细胞。为减轻细胞焦亡诱导的炎症，我们使用双硫仑作为抑制剂，显著缓解了过度炎症反应。本研究凸显了 PBQI 在研究极性、（ONOO-） 和细胞焦亡之间相互作用方面的实用价值。
探针PBQI的设计与光物理性质研究
本文介绍了 PBQI为检测生物系统中的极性和过氧亚硝酸盐（ONOO-））而设计的双通道荧光探针。在低极性环境中，该探针有利于从供电子基团到吸电子基团的高效分子内电荷转移（ICT），这种过程在低极性条件下更为显著。同时，探针呈现明显的聚集态，分子间相互作用减弱，这导致聚集诱导发光（AIE）现象，并产生强烈的近红外（NIR）荧光。当暴露于低极性环境时，探针的丙酸链部分会与（ONOO-）发生反应，终止光诱导电子转移（PET）过程并释放荧光团。该反应激活荧光，使得在 520nm 处的荧光信号显著增强。
PBQI 在低极性溶剂中表现出较高的量子产率。随着 1,4 - 二氧六环浓度的增加，PBQI 的紫外 - 可见吸收光谱未显示出任何额外的吸收峰。当溶液中 1,4 - 二氧六环的比例从 5% 上升到 99% 时，PBQI 在 700nm 处的荧光强度逐渐增强。PBQI 在 99% 的 1,4 - 二氧六环溶液中呈现出明显的丁达尔效应，这表明其具有聚集诱导发光特性。透射电子显微镜（TEM）分析证实了 PBQI 的纳米级聚集。PBQI 在 99% 1,4 - 二氧六环溶液（含 1% 水）中的粒径明显大于在 95% 水溶液（含 5% 1,4 - 二氧六环）中的平均粒径，这证实了 PBQI 在极性较低的 99% 1,4 - 二氧六环环境中发生了聚集。
随着加入过氧亚硝酸盐（ONOO-），520nm 处的荧光强度增强。在（ONOO-）浓度为 0 至 90pM 的范围内，存在良好的线性关系。测得的检测限为 1.5μM。加入（ONOO-）后，PBQI 在 520nm 处的荧光强度迅速增加，并在约 5 分钟时趋于稳定。将各种干扰分析物和加入到体系中，结果发现只有加入（ONOO-）时，PBQI 在 520nm 处的荧光强度才会显著增强，而加入其他分析物时，荧光强度变化极小。随后的验证证实，PBQI 对其他活性氧具有选择性和抗干扰性，这表明该探针的响应几乎不受它们存在的影响。在高极性溶剂中，光致电子转移（PET）效应会猝灭探针本身的荧光，而在低极性环境中，探针会发生明显的聚集行为，产生强烈的红色荧光。（ONOO-）的存在抑制了 PET 过程，导致探针的分子结构和电子分布发生变化，从而释放出荧光团，进而恢复其自身荧光。总之，PBQI 具有高选择性、稳定性和灵敏度的特点，使其成为生物分析中检测极性和（ONOO-）的可行候选探针。
细胞毒性和共定位
将 PBQI 与 Mito-Tracker Blue（线粒体追踪蓝）或 LDs-Tracker Blue（脂滴追踪蓝）在 37°C 下与 HeLa 细胞孵育 15 分钟，然后利用激光共聚焦显微镜评估其细胞定位。该探针高度靶向线粒体，共定位系数高达 0.92，表明其具有出色的线粒体追踪能力。此外，该探针对脂滴也表现出卓越的靶向效果，皮尔逊相关系数（PCC）达到 0.87。总之，探针 PBQI 对线粒体和脂滴均表现出优异的靶向效果，由于其细胞毒性极小，使其成为检测生物体内与这些细胞成分相关疾病的合适选择。与对照组相比，癌细胞的微环境极性较低，且活性氧（尤其是过氧亚硝酸盐，（ONOO-）浓度较高。 选取了两种癌细胞 ——HepG2 和 4T1，以评估 PBQI 通过检测极性和（ONOO-）水平来区分癌细胞和正常细胞的能力。用 PBQI 孵育后，这两种癌细胞在红色和绿色通道中均显示出增强的荧光。然后，用（ONOO-）的特异性清除剂 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）处理癌细胞。NAC 导致绿色通道荧光显著降低，而红色荧光基本不受影响。总之，PBQI 是一种灵敏且准确的工具，可用于对细胞极性和（ONOO-）浓度的波动进行成像，从而有助于区分癌细胞和正常细胞。
癌细胞焦亡过程中细胞内极性和（ONOO-）的成像
先前的研究揭示了细胞焦亡过程中的一系列关键生物学变化。特别是，发生焦亡的细胞表现出细胞极性降低，以及如（ONOO-）等活性氧（ROS）增加的现象。在癌细胞的焦亡过程中，这些变化，尤其是极性的降低和（ONOO-）水平的升高，会显著加剧。鉴于该探针在水溶液和细胞水平上对极性和（ONOO-）都具有出色的双响应特性，我们利用它来追踪各种癌细胞（特别是 HepG2 和 4T1 细胞）在焦亡过程中极性和\(ONOO^-\)浓度的变化。已有研究证实，脂多糖（LPS）是癌细胞焦亡的强效诱导剂。此外，某些抗癌药物，如顺铂（Cis-Pt）和二甲双胍（Met），已被证明能够引发癌细胞焦亡，从而发挥其抗肿瘤作用。在本研究中，我们选择了 LPS、顺铂和二甲双胍来开展后续的细胞焦亡实验。
用 50μM 的脂多糖（LPS）处理 HepG2 和 4T1 细胞 18 小时，随后加入探针 PBQI 进行荧光成像。观察发现，与对照组相比，经 LPS 处理的肿瘤细胞的囊泡形成增加，荧光成像显示绿色通道和红色荧光通道的信号都显著增强。此外，当肿瘤细胞接受抗癌药物顺铂（Cis-Pt）和二甲双胍（Met）处理时，也观察到类似的囊泡形成增加的现象。与对照组相比，绿色通道和红色通道的荧光强度都有明显变化。这些结果表明，PBQI 可用于监测肿瘤细胞在抗癌药物诱导的细胞焦亡过程中极性和（ONOO-）水平的波动。
抗癌药物诱导的荷瘤小鼠癌细胞焦亡成像
我们研究了荷瘤小鼠肿瘤模型中，抗癌药物引发的细胞焦亡过程中极性和（ONOO-）水平的动态变化。可以观察到，荷瘤小鼠在绿色通道和红色通道的荧光信号都明显强于对照组，并且随着肿瘤进展时间的延长，这种荧光增强的趋势变得越来越明显。同时，观察到经过 N - 乙酰半胱氨酸（NAC）预处理后，肿瘤部位的绿色荧光显著减弱。通过对分离的器官和肿瘤组织进行体外荧光成像，可以发现与正常组织相比，肿瘤组织中的荧光信号明显增强。此外，通过对组织切片进行荧光成像，我们观察到肿瘤组织中荧光信号的显著增强与体内成像结果一致。这些发现不仅证实了 PBQI 在区分肿瘤组织与正常组织方面具有高特异性和高灵敏度，也为肿瘤的早期诊断和追踪提供了新的视角。
总结
本研究介绍了 PBQI，这是一种新型的近红外荧光探针，具有检测细胞内极性和过氧亚硝酸盐（ONOO-）的双重功能。PBQI 具有高灵敏度和选择性，分别在 700nm 和 520nm 处对极性和（ONOO-）呈现出明显的荧光发射。它对细胞内线粒体和脂滴的精准靶向，为相关病理的早期诊断和治疗干预铺平了道路。我们的研究结果表明，在肝癌和乳腺癌小鼠模型中，PBQI 能够熟练地捕捉到顺铂和二甲双胍诱导的极性和（ONOO-）水平的实时变化。
参考文献
DevelopmentofaNear-InfraredProbeforEnhancingCancerTherapybyMitigatingPyroptosis-InducedInflammation，BinLi,WeikangPeng,ZhihangJin,ShushengZhang,LeiYang,*MingmingYu,*andZhanxianLi*，Anal.Chem.，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c07048
