内容提要
本研究工作通过分子工程开发了基于供体 -π- 受体（D-π-A）结构的硼二吡咯亚甲基（BODIPY）染料并应用于增强三阴性乳腺癌的光疗效果。通过噻吩工程改造和碘的引入，D-π-A 结构的 BDP 染料在单线态和三线态之间具有较低的能隙（ΔES1-T1）。将 BDP 染料制备成纳米颗粒（NPs）后，BDP4 纳米颗粒表现出增强的 I 型和 II 型活性氧（ROS）生成能力，以及较高的光热转换效率（44%）。
BODIPY 的合成
根据合成路线获得了四种 BODIPY 衍生物（BDP1、BDP2、BDP3 和 BDP4）。BDP1 是基于我们之前的工作合成的 。通过质子核磁共振(1H NMR）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）成功合成并评估了 BDP2、BDP3 和 BDP4。通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱分析了 BDP1-4 的光学性质。BDP1、BDP2、BDP3 和 BDP4 的最大吸收峰分别为 695、713、715 和 738nm。BDP1-4 的最大发射峰分别为 746、772、777 和 800nm。用噻吩基取代苯环后，与 BDP1 和 BDP3 相比，BDP2 和 BDP4 的吸收光谱和发射光谱发生了红移。在 BODIPY 核心中引入碘原子，使得 BDP3 和 BDP4 的吸收光谱和发射光谱相较于 BDP1 和 BDP2 发生了红移。碘的引入和噻吩的取代能够降低 （ΔEg ），从而导致 BDP4 的吸收光谱和发射光谱发生红移。使用商业 ROS 指示剂二氢罗丹明 123（DHR123）来测定超氧自由基（O2-）的产生。随着照射时间的延长，存在 BDP4 时 DHR123 溶液的荧光强度逐渐增强。存在 BDP4 时 DHR123 溶液的荧光强度提高了 10 倍，这比存在 BDP3 时更。在存在 BDP1 和 BDP2 时，几乎检测不到 DHR123 溶液荧光强度的变化。重原子碘化物的引入和苯环被噻吩基团取代促进了分子自旋 - 轨道耦合，并增强了 I 型 ROS 的生成。使用 1,3 - 二苯基异苯并呋喃（DPBF）作为(O2) 清除剂，并观察到 DPBF 在 418nm 处的吸收峰。在 808nm 激光照射 70s 后，存在 BDP3 或 BDP4 时 DPBF 的吸收峰明显下降，但存在 BDP3 时吸收峰下降的速度比存在 BDP4 时慢。没有碘原子的 BDP1 和 BDP2 在 808nm 激光照射下几乎不会导致 DPBF 吸收峰下降。BDP1、BDP2、BDP3 和 BDP4 的单线态氧量子产率分别为 0.24%、0.39%、5.27% 和 13.33%。这些结果证明 BDP4 在 BDP1-4 中具有最佳的 ROS 生成能力。进一步使用 SOSG 来评估(O2)的产生。存在 BDP3 时 SOSG 荧光提高了 6 倍，存在 BDP4 时提高了 12 倍，这与 DPBF 的结果一致。
BDP1-4 NPs 的制备与表征
为了解决 BODIPY 的疏水性问题，将 BDP1-4 与 1,2 - 二硬脂酰基 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸乙醇胺 - N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG2000）组装成纳米颗粒（NPs）。采用纳米沉淀法制备 BODIPY NPs（BDP1-4 NPs）。BDP1 NPs、BDP2 NPs、BDP3 NPs 和 BDP4 NPs 的分别为 703、722、732 和 751nm。与 BDP1-4 相比，BDP1-4 NPs 的吸收光谱更宽且发生红移，这是由于在纳米颗粒形成过程中它们的 π-π 堆积和聚集。与在 DMSO 中的游离 BDP 不同，由于聚集诱导猝灭，几乎检测不到 BDP1-4 NPs 的荧光，这表明纳米颗粒合成成功。通过透射电子显微镜（TEM）证实了 BDP NPs 的球形形态。TEM 测量的尺寸与 DLS 测量的尺寸一致。此外，它们在室温下稳定一周，尺寸或多分散指数（PDI）没有变化，这揭示了纳米颗粒优异的胶体稳定性。通过动态光散射（DLS）测定平均流体动力学直径和平均多分散指数（PDI），BDP1 NPs、BDP2 NPs、BDP3 NPs 和 BDP4 NPs 的尺寸分别为 140、112、108 和 129nm，PDI 分别为 0.22、0.23、0.30 和 0.21。此外，BDP1-4 NPs 在含有 10% 胎牛血清（FBS）的罗斯威尔公园纪念研究所 1640 培养基（Roswell Park Memorial Institute 1640 medium）中储存 24 小时，尺寸和 PDI 的变化可以忽略不计，这证实了 BDP1-4 NPs 在生理条件下是稳定的，可用于生物应用。随着 BDP1-4 NPs 浓度从 20μg/ml 增加到 100μg/ml，在 808nm 激光照射(0.9W/cm2 ）下，BDP1-4 NPs 在水中的温度迅速升高。在 BODIPY 浓度为 40μg/ml 时，BDP1 NPs、BDP2 NPs、BDP3 NPs 和 BDP4 NPs 的温度分别升高了 11.5、21.1、13.2 和 25.6℃。BDP4 NPs 在 BDP1-4 NPs 中呈现出最高的温度和最佳的光热性能。所有纳米颗粒的温度都随着激光照射功率密度的增加而升高，这表明 BDP1-4 NPs 的光热能力与功率有关。经过五次激光开关加热循环后，纳米颗粒升高的温度几乎保持不变，这表明它们具有优异的光热稳定性。计算得出 BDP1 NPs、BDP2 NPs、BDP3 NPs 和 BDP4 NPs 的光热转换效率（PCE）分别为 29.2%、39.4%、32.2% 和 44.0%。BDP4 的供电子三苯胺基团和吸电子噻吩基团通过分子间 π-π 堆积进行分子间电子转移，导致S1态的能量通过非辐射跃迁途径到达S0态，因此 BDP4 NPs 在 BDP1-4 NPs 中具有最佳的光热能力。
BDP4 NPs 体外肿瘤靶向特异性
为了增强对 4T1 细胞的靶向特异性，用靶向配体（FA 和 cRGD 肽）对 BDP4 NPs 进行进一步修饰。为了筛选合适的靶向配体和靶向配体密度，将 BDP4 与 DSPE-PEG-FA/DSPE-PEG-cRGD 和 DSPE-PEG 以 5:95、10:90 和 20:80 的不同投料比共组装，构建肿瘤靶向纳米颗粒（分别命名为 5% FA-BDP4 NPs、10% FA-BDP4 NPs、20% FA-BDP4 NPs、5% cRGD-BDP4 NPs、10% cRGD-BDP4 NPs 和 20% cRGD-BDP4 NPs）。通过 DLS 测量，5% FA-BDP4 NPs、10% FA-BDP4 NPs、20% FA-BDP4 NPs、5% cRGD-BDP4 NPs、10% cRGD-BDP4 NPs 和 20% cRGD-BDP4 NPs 的尺寸分别为 161、136、148、189、173 和 170nm。然后，使用流式细胞术分析来量化纳米颗粒被 4T1 细胞内吞和解离时的荧光强度。用 5% FA-BDP4 NPs、10% FA-BDP4 NPs 和 20% FA-BDP4 NPs 孵育后，4T1 细胞中的荧光强度分别比用 5% cRGD-BDP4 NPs、10% cRGD-BDP4 NPs 和 20% cRGD-BDP4 NPs 孵育的细胞强 100%、400% 和 20%。结果证实，在相同投料比下，用 FA 修饰的纳米颗粒比用 cRGD 修饰的纳米颗粒对 4T1 细胞具有更强的靶向能力。此外，10% FA-BDP4 NPs 对 4T1 细胞表现出最佳的靶向性，与用 5% FA-BDP4 NPs 和 20% FA-BDP4 NPs 孵育的细胞相比，用 10% FA-BDP4 NPs 孵育的细胞中的荧光强度分别增加了 15% 和 12%。此外，细胞中的荧光随着时间的推移逐渐增加，这表明纳米颗粒可以在肿瘤细胞的酸性和富含酶的环境中被内吞和解离。用 10% FA-BDP4 NPs 孵育的细胞的荧光比用 BDP4 NPs 孵育的细胞更强，证实了 10% FA-BDP4 NPs 优异的肿瘤靶向能力。
FA-BDP4 纳米颗粒在体内的靶向能力和光疗效果
为了研究 10% FA-BDP4 纳米颗粒在体内的肿瘤靶向能力，给 4T1 荷瘤小鼠静脉注射 BDP4 纳米颗粒或 10% FA-BDP4 纳米颗粒，并在特定时间拍摄小鼠的近红外荧光图像。随着时间推移，肿瘤部位的近红外荧光逐渐增强，这表明纳米颗粒在肿瘤部位积累并解离。在同一时间点，10% FA-BDP4 纳米颗粒的近红外荧光强度比 BDP4 纳米颗粒更强。对肿瘤部位荧光强度的定量分析证实，在 8 小时和 24 小时时，10% FA-BDP4 纳米颗粒的荧光强度比 BDP4 纳米颗粒更强，这表明由于 FA 对 4T1 细胞的肿瘤靶向特异性，10% FA-BDP4 纳米颗粒在肿瘤部位的积累量比 BDP4 纳米颗粒更多。同时，在注射 10% FA-BDP4 纳米颗粒 24 小时后，切除的主要器官的荧光信号主要分布在肝脏、脾脏和肿瘤中，这证实了 10% FA-BDP4 纳米颗粒能够主动靶向 4T1 肿瘤，并通过肝脏和脾脏进行体内代谢过程。
当肿瘤大小达到 80 - 100 mm3 时，将小鼠随机分为六组（n = 5 ）：PBS 组、光照组（L）、BDP4 纳米颗粒组、10% FA-BDP4 纳米颗粒组、BDP4 纳米颗粒 + 光照组（BDP4 NPs + L）和 10% FA-BDP4 纳米颗粒 + 光照组（10% FA-BDP4 NPs + L）。在小鼠静脉注射 BDP4 纳米颗粒或 10% FA-BDP4 纳米颗粒（6mg/kg，200μL）8 小时后，对光照组、BDP4 纳米颗粒 + 光照组和 10% FA-BDP4 纳米颗粒 + 光照组小鼠的肿瘤部位进行 808nm 激光照射（功率强度为(0.8W/cm2) ，照射 10 分钟）。10% FA-BDP4 纳米颗粒 + 光照组的肿瘤温度升高到 55.1℃，而光照组和 BDP4 纳米颗粒 + 光照组的肿瘤温度仅分别达到 40.4℃和 50.6℃。与 BDP4 纳米颗粒相比，10% FA-BDP4 纳米颗粒在肿瘤中积累更多，在体内能提供更好的光疗效果。10% FA-BDP4 纳米颗粒 + 光照组的所有肿瘤都被完全根除，而 BDP4 纳米颗粒 + 光照组的肿瘤生长明显受到抑制。22 天后，接受 PBS、光照、BDP4 纳米颗粒和 10% FA-BDP4 纳米颗粒处理的小鼠的肿瘤体积逐渐增加到 1200 - 1500 \(mm^{3}\) 。BDP4 纳米颗粒 + 光照组的肿瘤体积在 10 天后逐渐增加，而 10% FA-BDP4 纳米颗粒 + 光照组在 22 天内未观察到肿瘤复发。这些结果表明，经 808nm 激光照射的纳米颗粒具有优异的治疗效果，带有肿瘤靶向配体（FA）的纳米颗粒可以进一步增强对 4T1 肿瘤的治疗效果。
总结
本研究合成了四种具有 D-π-A 结构的硼二吡咯亚甲基（BODIPY）并制备成纳米颗粒（NPs），以增强光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT）的效果。用噻吩基取代苯环作为受体，在 BODIPY 核心的 π 共轭桥中引入碘原子，并以三苯胺基作为供体，最终得到了具有高 D-π-A 强度的 BDP4。通过密度泛函理论（DFT）计算可知，D-π-A 结构使 BDP4 的能隙（ΔEg ）最小，为 1.86 电子伏特，单线态与三线态之间的能量差（ΔES1-T1）最低，为 0.71 电子伏特。这促进了非辐射弛豫，增加了系间窜越（ISC）的能量跃迁通道，并增强了分子内电荷转移（ICT）效应。此外，BDP4 与 1,2 - 二硬脂酰基 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸乙醇胺 - N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG2000）共组装形成 BDP4 NPs，其光动力和光热性能均得到增强。BDP4 NPs 具有更强的 I 型和 II 型活性氧（ROS）生成能力，以及高达 44% 的光热转换效率，这与 DFT 计算结果相符。
参考文献
Thiophene engineering of near-infrared D-π-A nano-photosensitizers for enhanced multiple phototheranostics and inhibition of tumor metastasis， Xingyu Zhaoa, Jiaping Shena, Huixuan Qia, Juan Suna, Bin Xua, Lei Taoa, Wenhai Lina*, Shengliang Li*, Zhiyuan Zhonga*， Journal of Colloid And Interface Science 685 (2025) 291–303 ，
https://doi.org/10.1016/j.jcis.2025.01.118
