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内容提要

   本文设计了一种近红外（NIR） spiro-AIEgen TTQ-SA，通过辅助dnazyme调节的肿瘤细胞致敏来提高PTT。初步制备出具有独特分子结构和封装方式的TTQ-SA，使其具有较强的AIE效应、良好的PL量子产率和良好的光热性能。DNAzyme作为基因沉默工具，可以缓解PTT的抗凋亡反应。通过将TTQ-SA和DNAzyme整合到叶酸修饰的聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）聚合物中，制备的纳米系统可以促进细胞凋亡并使肿瘤细胞对PTT敏感，从而最大化治疗效果。该纳米系统结合spiro- aiegen为基础的PTT和dnazyme为基础的基因沉默，在肿瘤靶向方面显示出良好的近红外和光热成像能力，并对原位乳腺癌显示出显著的细胞凋亡、抗肿瘤和抗转移作用。此外，在自发的MMTV-PyMT转基因小鼠中实现了协同抗肿瘤作用。

分子设计和光物理性质评价

   TTQ是根据Ding等人的工作合成的。通过缩合反应得到旋锁型近红外AIEgen TTQ-SA为了了解TTQ和TTQ- sa的光物理特性，研究了TTQ和TTQ- sa在甲苯溶液（10 - 5 M）中的紫外-可见吸收和PL光谱，两者在500和700 nm之间表现出明显的电荷转移（CT）吸收。由于显著的分子内CT相互作用，TTQ和TTQ- sa实现了近红外发射，使其吸收和发射光谱适合于成像和PTT的应用。具体来说，对于TTQ-SA，螺旋单元的引入中断了TTQ和SA单元之间的通键共轭和TBCT。反过来，螺旋结构促进了TTQ和SA单元之间的TSCT和同共轭，从而允许光谱的微调。TTQ- sa的CT吸收峰（633 nm）比TTQ （620 nm）红移了13 nm。与TTQ （744 nm）相比，TTQ- sa （752 nm）的PL发射峰红移了8 nm。此外，我们发现TTQ- sa在甲苯溶液（10−5 M）中的PLQY高达19.7%，略弱于TTQ (PLQY = 24.5%)，这与单晶分析和理论计算结果一致。我们进一步研究了TTQ和TTQ- sa的AIE性能。图中显示了四氢呋喃(THF)/水混合物中典型的AIE特征。值得注意的是，TTQ- sa具有更强的AIE特性，其AIE系数（αAIE，即聚集态的发射强度与初始溶液的发射强度之比）为1.48，而TTQ在聚集时的发射强度始终弱于其初始发光强度（αAIE = 0.99）。这表明螺旋结构的引入有效地抑制了聚集态的ACQ现象，这在晶体分析部分已经得到了充分的解释。基于TTQSA良好的光物理性质，我们研究了其在660 nm激光照射下的光热效应。TTQ的升温幅度为14℃（70 μg·mL⁻¹,0.6 W·cm⁻²,5 min）。在相同条件下，螺旋锁定的TTQ-SA获得了41℃的温升。图中F中的红外照片也证实了TTQ-SA具有良好的光热转换性能，这与理论计算结果一致。此外，TTQ-SA的光热转换性能显示出功率密度依赖和浓度依赖的行为，表明TTQ-SA具有高度敏感的光热转导。热转换效率为56.2%。TTQ-SA的光热稳定性也被评估， TTQ-SA的光热谱保持稳定和可逆，即使经过六个连续的照射和冷却循环，使其成为进一步肿瘤治疗的潜在光热剂。

D/FTS纳米体系的制备与体外研究

   为了加强PTT的作用，引入基因沉默使肿瘤细胞对PTT敏感，叶酸修饰也用于肿瘤靶向递送以减少对健康生物体的损害。因此，通过将AIEgen TTQ-SA和DNAzyme整合到famo修饰的PLGA纳米系统（称为D/FTS纳米系统）中，构建了靶向肿瘤的NPs，用于协同PTT和GT。首先，将10−23 DNAzyme加载到ZIF-8中，制备DNAzyme/ZIF-8 （DNA/ZIF-8）。ZIF-8包封不仅可以保护DNAzyme，还可以提供切割survivin mRNA所需的Zn²⁺辅因子。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）（插图）图像显示了DNA/ZIF-8 NPs的结构。SEM能量色散x射线光谱（EDX）和UV - vis光谱进一步支持DNAzyme的成功加载（。在此基础上，将TTQ-SA和DNA/ZIF-8包封在fa修饰的PLGA聚合物50中，采用一步双乳液溶剂蒸发法制备肿瘤特异性D/FTS NPs。SEM和TEM（插图）图像证实了D/ FTS NPs的核-壳结构，这与仅封装ttqsa的fa修饰PLGA聚合物形成鲜明对比。D/FTS NPs显示出浓度依赖的光热转换模式。局部热疗50°C时，D/FTS NPs表现出热响应特征，其形态变化可见。DNA/ZIF-8和D/FTS NPs的平均水动力直径分别为68.7 nm和197.6 nm。DNAzyme加载后，zeta电位从+11.4 mV （ZIF8）下降到- 20.1 mV (DNA/ZIF8)，而D/FTS NPs的负电荷更多，为- 27.5 mV。

   为了确保survivin mRNA随后下调以促进肿瘤细胞凋亡，我们在体外研究了DNAzyme的裂解条件。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测发现，辅助因子Zn²⁺的孵育时间为1 h，浓度为0.1 m。在这些条件下，超过85%的底物被切割。然而，在没有辅助因子Zn²⁺的情况下，荧光强度几乎没有变化，与PAGE结果一致。为了深入了解DNAzyme与底物结合的作用，我们设计了一个突变体DNAzyme。正如预期的那样，荧光强度要低得多。因此，辅助因子Zn²⁺和DNAzyme的精确设计是成功切割底物的关键。此外，通过引入生命体系中存在的其他干扰金属离子（Mg2+和Fe2+），证明了只有辅因子Zn²⁺才能触发明显的荧光响应。我们进一步研究了富含Zn²⁺的ZIF-8是否可以在不需要额外补充游离Zn²⁺的情况下支持DNAzyme活性。在这里，将D/FTS添加到模拟溶酶体酸性环境的培养基中。体外ICP - MS分析也表明，pH值为5.0时，D/FTS NPs中有pH刺激的Zn²⁺释放，而pH值为7.4时，检测到的Zn²⁺可以忽略不计。孵育4小时后，Pearson相关系数从0.71降至0.33，表明随后分解的D/FTS NPs核内体逃逸。细胞内Zn²⁺浓度升高至114.8 μM，为DNAzyme调控提供了充足的辅因子。酸性溶酶体有利于D/FTS NPs的ph响应性分解，促进Zn²⁺作为DNAzyme辅助因子的释放，用于survivin mRNA的裂解。

   采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流式细胞术分析肿瘤细胞和正常细胞对D/ FTS和D/TS NPs（未加叶酸修饰）的细胞摄取情况。CLSM图像显示，fa修饰的D/FTS比D/TS产生更强的红色荧光，这意味着肿瘤MCF-7细胞对fa介导的细胞摄取更有效。此外，通过用过量的游离叶酸预处理MCF-7，图中的竞争实验也表明叶酸受体介导的摄取。然而，与正常细胞NIH/3T3处理时，D/FTS表现出有限的摄取，与D/TS NPs相似，这可能归因于其很少表达FA受体。这些结果与图中的流式细胞术检测结果一致。因此，叶酸修饰有利于增强D/FTS对肿瘤细胞的靶向能力，这也有利于减少ptt过程中对正常细胞的损伤。此外，D/FTS在2 h时发出的红色荧光与LysoTracker green的绿色荧光可以很好地重叠，表明FA受体辅助内吞作用。Survivin是参与肿瘤侵袭性和治疗反应的关键基因，阻碍了ptt的有效性。25−27在图中，42°C的MCF-7细胞热休克处理导致Hsp90和Survivin的表达显著增加（通道1,2）。基因相互作用分析的结果也表明它们之间存在丰富的物理相互作用。26,27在引入热休克抑制剂Tanespimycin （17-AAG）后，25还观察到survivin表达的显著剂量依赖性丧失（通道3,4）。survivin表达的抑制可以促进高温下细胞凋亡，正如活性caspase-3水平的增强（通道3和4）所证明的那样，caspase-3水平的增强可以抑制肿瘤细胞的增殖，从而提高PTT效率。转染DNAzyme （0.1 mM Zn²⁺作为辅助因子）也可导致survivin （lane 5）表达明显下降，激活caspase-3，促进细胞凋亡，有利于肿瘤细胞对PTT的增敏。

皮下乳腺癌的体内显像及GT和PTT联合治疗

   由于D/FTS NPs具有协调的荧光和光热特性，我们对荷瘤小鼠进行了荧光和光热成像，以探索其静脉给药后的生物分布。注射后跟踪D/FTS （FA修饰组）和D/TS NPs（未FA修饰组）两组。D/ fs处理组，肿瘤内荧光强度在9 h内显著增强，并有轻微衰减，可能是自发消除所致。大多数荧光信号主要在肿瘤部位观察到，表明有利的肿瘤靶向性。相比之下，未经FA修饰的D/ ts处理组，小鼠全身可见荧光信号。由于FA修饰，D/FTS NPs表现出更好的肿瘤积累，在肿瘤部位显示出更高的荧光信号，而D/TS主要在小鼠肝脏中积累，在肿瘤中较少。定量分析证实FA修饰有利于肿瘤靶向。我们还检测了D/FTS NPs的体内光热效应。pbs处理组即使在照射5分钟后也引起了更低的温度变化。然而，我们发现D/FTS治疗小鼠具有明显的光热转换效应，激光照射仅3 min，肿瘤温度升高至47℃，明确揭示了D/FTS潜在的杀瘤作用。这些发现促使我们进一步探索D/FTS NPs在体内抗肿瘤应用的潜力。本文选择皮下MCF-7荷瘤裸鼠，评估不同治疗后的治疗效果。1所示，PBS （I组）和DNAzyme突变的mD/FTS （ii组）治疗的小鼠肿瘤体积明显增加。仅未照射的D/FTS （iii组，GT）或照射的mD/FTS治疗的小鼠（iv组，PTT）显示出中度肿瘤抑制。照射下靶向D/FTS治疗（第六组，GT + PTT）对肿瘤生长的抑制作用最为明显。因此，辅助GT有利于提高PTT的抗肿瘤效率。然而，在没有FA靶向的情况下，D/TS治疗小鼠（v组，GT + PTT）在照射下观察到适度的肿瘤抑制。图中的肿瘤重量记录有力地证实了肿瘤靶向D/FTS治疗（vi组）的高效治疗效果，结合了aiegen为基础的PTT和dnazyme为基础的GT。此外，GT或PTT治疗后，肿瘤组织中活性caspase-3的表达显著增强，特别是在D/FTS照射下的小鼠（ vi组，GT + PTT），直接揭示了治疗的凋亡机制。TUNEL染色也证实了明显的细胞凋亡，特别是在D/FTS NPs照射下的组织中。此外，H&E染色结果也与上述观察结果一致，共同提示肿瘤靶向和协同GT和PTT的优越治疗效果。

总结

   充分利用TTQ-SA在近红外和光热成像中的指标，以及光热转换和DNAzyme调控来解决高温诱导的抗凋亡反应，实现了高效、准确的成像引导PTT。首先，刚性螺旋锁定的TTQ-SA呈现出弯曲的构象，促进了分子内的TSCT、同共轭和强的分子内相互作用。TTQ-SA弯曲的分子结构进一步导致了适度的RIM效应和弱的空间限制环境，抑制了聚集状态下有害的π−π堆积。因此，TTQ-SA聚集体具有协调的PL和光热性能，这使得TTQ-SA同时具有优异的成像和PTT性能。此外，DNAzyme作为基因沉默工具抑制survivin mRNA，可诱导细胞凋亡，增加肿瘤细胞对PTT的敏感性。最后，将TTQ-SA和DNAzyme整合到叶酸修饰的PLGA聚合物中，制备了D/FTS纳米体系，并通过近红外和光热成像证实了该体系的肿瘤靶向定位。体外和体内实验结果表明，D/ FTS纳米体系能够显著减轻抗凋亡反应，从而对原位和自发性乳腺癌产生显著的抗肿瘤和抗转移作用。

参考文献

EngineeringaNear-InfraredSpiro-BasedAggregation-InducedEmissionLuminogenforDNAzyme-SensitizedPhotothermalTherapywithHighEfficiencyandAccuracy， YingyingChen,Sheng-YiYang,XinwenOu,HuiWang,Fan-ChengKong,PhilipC.Y.Chow,

YifeiWang,YuqianJiang,WeiZhao,JianweiSun,RyanT.K.Kwok,Di-WeiZheng,WenqianYu,*FuanWang,*JackyW.Y.Lam,*andBenZhongTang*， J.Am.Chem.Soc.，https://doi.org/10.1021/jacs.4c14818