内容提要
本研究合成了CZTBT和LVTBT两种构型不同的异构体。LVTBT具有较平坦的分子结构，具有较长的吸收波长和较高的摩尔消光系数。其激发态有利于非辐射跃迁的强旋转，光热转换效率（PCE）高达36.3%。当与R848联合使用时，LVTBT@R848纳米颗粒（NPs）介导的光热免疫疗法作为原位肿瘤疫苗，促进树突状细胞（dc）的成熟、T细胞的浸润、自然杀伤细胞（NK）细胞和记忆T细胞的分化，从而激活强烈的免疫应答。因此，它能显著抑制原发肿瘤和远处肿瘤的生长，同时也能限制肺转移。
分子合成及其光物理性质研究
CZTBT和LVTBT是通过咔唑衍生物与4,8-二溴-6-（2-乙基己基）-[1,2,5]噻二唑[3,4-f]苯并三唑（TBT）之间的直接铃木偶联反应合成的。在这种分子结构中，咔唑衍生物作为电子给体(D)， TBT作为电子受体(A)，形成了具有D - A - D结构的opta。CZTBT和LVTBT是通过咔唑环或苯环与中心核心结构的连通性来区分的异构体。CZTBT和LVTBT的最大吸收峰分别在711 nm和746 nm处，在808 nm处的摩尔消光系数分别为960和20000 Lmol -1 cm-1。值得注意的是，它们的光致发光（PL）波长从700到900 nm不等，使近红外荧光成像（NIR FLI）引导治疗成为可能。为了在肿瘤部位准确释放R848，采用可应答谷胱甘肽（GSH）的DSPESS-PEG2000作为纳米载体。采用纳米沉淀法合成了水分散的CZTBT、LVTBT和LVTBT@R848 NPs紫外/可见光谱显示在676、724和725 nm处有较宽的吸收峰，吸光度高于808 nm处的溶液。此外，PL分析表明，溶液中的发射波长相似，分别为789,811和816 nm。透射电镜（TEM）证实所有NPs均为球形。例如，LVTBT@R848 NPs的直径约为100 nm，这与动态光散射（DLS）测量结果一致。如图所示，LVTBT NPs和LVTBT@R848 NPs的平均水动力直径分别约为140.97 nm和149.22 nm。研究了LVTBT@R848对GSH有反应并能释放R848的NPs。在GSH浓度为10 mM时，观察到随着孵育时间的增加，3天内R848的释放量接近89%。
由于NPs在808 nm处具有显著的光吸收，我们系统地评估了NPs在808 nm激光照射下的光热转换能力。与水或CZTBT NPs相比，LVTBT NPs和LVTBT@R848 NPs表现出优越的光热性能。当功率密度为0.6 Wcm-2的808 nm激光照射60 s时，水的温度和NPs分别为27.0、37.7、65.1和67.5℃。随后，我们在808 nm激光照射下检测了不同浓度LVTBT@R848 NPs对温度升高的响应。如图所示，产生的热量随浓度的增加而增加，特别是在浓度为100 μgmL-1时观察到明显的热效应。我们还分析了不同激光功率密度对LVTBT@R848热效率的影响，发现激光功率密度的增加与由此产生的温升之间存在明显的相关性。在一致的808 nm激光照射下，通过三个加热和冷却循环评估LVTBT@R848 NPs的光热稳定性。观察到LVTBT@R848 NPs的最高温度没有明显下降，说明其光热稳定性好。相反，在相同条件下，商业染料ICG的最高温度明显下降。CZTBT NPs、LVTBT NPs和LVTBT@R848 NPs的PCE （η）分别为18.7%、34.5%和36.3%。此外，LVTBT@R848 NPs的光声（PA）信号强度与浓度呈强线性相关，强调了它们在PA成像应用中的重要潜力。
体外抗肿瘤性能
流式细胞术结果显示LVTBT@R848 NPs细胞内相对红色荧光强度显著增加，从0 h时的4.85%上升到12 h时的96.3%，24 h时变化最小（99.9%）。因此，确定12 h为最佳内化时间。接下来，使用商业的4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）和Lyso-Tracker Green来研究LVTBT@R848 NPs的亚细胞细胞器靶向特性。如图所示，LVTBT@R848 NPs的红色荧光信号与Lyso-Tracker green的绿色荧光信号明显重叠，表明LVTBT@R848 NPs主要定位于溶酶体，Pearson’s R值高达0.88。采用标准细胞计数试剂盒-8 （CCK-8）测定R848、LVTBT NPs和LVTBT@R848 NPs的光毒性和暗毒性。LVTBT@R848 NPs处理的Beas2b细胞在黑暗条件下保持较高的活力，表明其具有良好的生物相容性。同样，LVTBT NPs和LVTBT@R848 NPs对EMT6细胞都表现出最小的暗毒性，在50 μgmL-1的孵育浓度下，平均存活率超过94%。虽然低浓度的R848具有良好的生物相容性，但较高浓度的R848具有显著的细胞毒性。激光照射下，LVTBT@R848 NPs对EMT6细胞的毒性呈浓度依赖性。当激光照射浓度为50 μgmL-1时，细胞活力降至5%以下，显示出显著的光疗效果。随后，使用JC-1荧光染料评估EMT6细胞的线粒体损伤。在LVTBT@R848 NPs+激光(L)组中，观察到最明显的绿色荧光，表明线粒体膜电位最低，线粒体损伤最严重。同样，钙黄素- am和碘化丙啶（PI）染色显示LVTBT@R848 NPs+L组的肿瘤细胞杀伤能力最强。此外，流式细胞术对凋亡细胞的定量分析支持了这些发现，显示LVTBT@R848 NPs+L组晚期凋亡细胞比例增加，占83.5%，显著高于其他组。这些结果表明LVTBT@R848 NPs可以被EMT6细胞有效吸收，从而诱导肿瘤细胞在辐照下发生凋亡。在PTT过程中，产生的热量有可能损伤线粒体，导致细胞色素C （Cyt-c）释放增加，并促进caspase-3 （C-caspase-3）裂解为活性形式，最终诱导PTT介导的肿瘤细胞凋亡。为了更深入地了解LVTBT@R848 NPs引起细胞损伤的机制，我们进行了western blot （WB）实验。WB结果证实，LVTBT@R848 nps介导的PTT后，Cyt-c和C-caspase-3的表达水平均显著上调。此外，PTT被发现通过刺激DAMPs的释放触发肿瘤细胞的ICD。DAMPs的关键标志物包括高迁移率组盒1 （HMGB1）、钙网蛋白（CRT）和三磷酸腺苷（ATP），它们在增强TAAs的识别和递呈中起关键作用，从而激活有效的适应性免疫治疗。WB和免疫荧光染色证实LVTBT@R848 NPs+L导致最明显的CRT暴露和HMGB-1释放。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测HMGB1和ATP的表达。LVTBT@R848 NPs+ L处理的EMT6细胞上清液中HMGB1和ATP的浓度明显高于其他各组。为了证实释放的DAMPs是否可以增强树突状细胞（DCs）的抗原呈递能力，我们通过体外共培养实验对DC2.4细胞成熟进行了初步评估。具体来说，未成熟的DC2.4细胞与EMT6细胞共培养，并通过流式细胞术分析CD80和CD86共刺激分子的比例来评估成熟度。与其他组相比，LVTBT@R848 NPs联合激光治疗导致成熟dc的比例显著增加（高达31.4%）。
体内多模态成像和代谢
LVTBT@R848 NPs强烈的近红外发射特性和良好的生物相容性促使其在体内荧光成像的评价。通过皮下植入EMT6细胞建立BALB/c小鼠的荷瘤模型。静脉注射LVTBT@R848 NPs后，1小时内肿瘤部位可见明显的荧光信号。随着时间的推移，LVTBT@R848 NPs在肿瘤部位的积累增加，在注射后12小时达到峰值。随后，NPs逐渐代谢，荧光信号减弱。PA成像和相应的定量分析证实了这些发现。LVTBT@R848 NPs在肿瘤内的优先保留增强了它们在体内光热成像（PTI）中的潜力。如红外热图像所示，用808 nm激光（0.6 Wcm-2,5 min）照射LVTBT@R848 nps治疗的肿瘤后，肿瘤部位温度从35.0°C上升到55.8°C （ΔT= 20.8°C）。值得注意的是，肿瘤区域的热疗（52.3°C）在照射后仅一分钟即可实现。相反，在相同条件下注射生理盐水时，没有观察到明显的温度升高。LVTBT@R848 NPs快速有效的体内光热转化能力强调了它们在有效光热免疫治疗中的潜力。随后，还评估了小鼠LVTBT@R848 NPs的代谢。24小时后LVTBT@R848 NPs广泛分布于血液、肝脏、肺、胃、肠中，肿瘤内NPs浓度最高。到第5天，血液中LVTBT@R848 NPs的荧光强度明显降低，主要集中在肠道内。10天后，胃中仅检测到微弱的荧光，其他主要器官和肿瘤中几乎检测不到NPs的荧光。这表明大部分LVTBT@R848 NPs在10天后从体内排出。
体内抗肿瘤性能
通过15天的随访，严格评估LVTBT@R848 nps介导的光热免疫疗法的抗肿瘤效力。原发肿瘤大小为90mm3的EMT6荷瘤小鼠随机分为5个治疗组：(I) PBS；(2) R848;（三）LVTBT NPs；（四）LVTBT@R848 NPs；(V) LVTBT@R848 NPs + L.在给药LVTBT@R848 NPs后，“L”组的原发肿瘤在注射12小时后暴露于808 nm （0.6 Wcm 2）激光下5分钟。每三天记录两侧肿瘤体积以评估治疗效果。
在治疗期间，PBS、R848和LVTBT NPs组原发肿瘤生长不受控制，表明单独使用R848或LVTBT NPs不足以抑制肿瘤进展。在LVTBT@R848 NPs组中，与PBS组相比，原发肿瘤的体积减少了约22.6%，这归因于gsh枯竭诱导的氧化还原失衡和R848的双重作用。LVTBT@R848 NPs+ L组有效抑制肿瘤侵袭性生长，同时伴有肿瘤消融和结痂形成，抑制率达到97.74%。在远端肿瘤中也发现了类似的结果。PBS和R848 NPs组的远端肿瘤分别约为557 mm3和534 mm3。值得注意的是，LVTBT@R848 NPs联合激光照射可显著抑制远处肿瘤生长，抑制率为81.2%。提取肿瘤的照片进一步证实了LVTBT@R848 NPs在808 nm激光照射下具有优越的抗肿瘤效果。如图所示，LVTBT@R848 NPs +L组原发和远处肿瘤的平均重量分别仅为PBS对照组的3.6%和21.5%。脾脏肿大的减少进一步支持LVTBT@R848 NPs +激光的优越抗肿瘤效果各组小鼠的体重差异极小，表明LVTBT@R848 NPs副作用低。
总结
CZTBT和LVTBT，仅在分子构型上不同，但表现出截然不同的光热转化能力。与CZTBT相比，LVTBT在808 nm处表现出更大的吸收范围和更好的光收集能力，这可归因于其平坦的结构。理论计算和fs-TA光谱结果表明，LVTBT的二面体旋转更明显，衰变曲线更快，表明LVTBT的结构对激发态动力学的影响更显著，有利于更有效的非辐射跃迁。与R848合作，LVTBT@R848 nps介导的光热免疫疗法作为原位肿瘤疫苗，在激光照射下有效地消除肿瘤细胞并诱导ICD。此外，这一过程促进了DMAPs的释放、抗原呈递、dc成熟和T细胞浸润，从而有力地激活了全身免疫。体内实验表明，原发肿瘤和远处肿瘤的生长分别被抑制97.74%和81.2%，肺转移受限。总的来说，本研究强调了一种有前途的构型介导的非辐射转变策略，它具有先进光热免疫治疗的潜力，并扩大了opta设计和合成的范围。
参考文献
Configuration-Mediated Efficient Non-Radiative Transition for R848Assisted Photothermal Immunotherapy to Inhibit Tumor Growth andMetastasis by An In Situ Tumor Vaccine Strategy， Jianan Dai , Laiping Fang , Xuan Wang, Jie Hua, Yike Tu, Shufang Li, Kuo He,Lifeng Hang, Yuan Xu, Jin Fang, Lina Wang, Jin Wang,* Ping’an Ma,* and Guihua Jiang*， Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202417871，https://doi.org/10.1002/anie.202417871
