内容提要
神经递质又称化学信使，是神经信号转导的执行者，其水平或功能的异常与各种神经退行性疾病和精神障碍密切相关，因此准确检测其水平和活性对相关疾病的研究具有重要意义，但传统的分析工具无法实现神经递质的原位、无创检测。分子探针、由于具有设计灵活、时空分辨率高、原位非侵入性标记等优点，能够通过分子反应或组装对靶分子产生响应，在分子识别领域具有广阔的应用前景，因此受到广泛关注。
乙酰胆碱的分子探针
乙酰胆碱（Ach）是一种单胺类神经递质，在体内由胆碱乙酰转移酶合成。乙酰胆碱广泛分布于神经系统，主要参与觉醒、休眠和意识等生理活动。乙酰胆碱与水溶性对磺酰基 [n] 芳烃具有高亲和力。Yasuhiro Ooi 等人以罗丹明 6G 为荧光客体构建了探针 1，并将其添加到二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）囊泡中，降低了荧光团的荧光强度。加入乙酰胆碱后，荧光团从囊泡中竞争性排出荧光强度增强，初步实现了乙酰胆碱的荧光检测。Shlomo Yitzchaik 等人设计了探针2，使用甲基吡啶衍生物作为荧光团，与水溶性芳烃结合来检测乙酰胆碱。乙酰胆碱可破坏上述共轭化合物，导致荧光强度发生变化。由于该探针的量子产率高，能够检测到微摩尔浓度的乙酰胆碱，大大提高了探针的应用性能。Takashi Jin 基于上述机制设计了一种乙酰胆碱近红外荧光探针。作者首先研究了不同 n 值的对磺酰基 [n] 芳烃与不同染料（罗丹明 800 和吲哚菁绿）的结合性能，确定了 Rh800 和 S [8] 为最佳组合，并构建了探针 3。同样，乙酰胆碱置换荧光团，导致荧光强度发生变化，从而实现了乙酰胆碱的近红外荧光检测。
半隐冠醚是由环戊二烯（CTV）单元组成的主体化合物，通过调节其空腔大小和形状可选择性地与不同客体结合。Martinez 研究小组将萘与上述化合物有机结合，赋予主体荧光性质，构建了荧光探针 4。基于 CTV 单元与神经递质铵部分的相互作用，实现了对乙酰胆碱的识别，并提供了开启型荧光信号。更重要的是，该探针对乙酰胆碱和胆碱具有一定的选择性。上述研究小组报道了一系列可检测乙酰胆碱的荧光探针（5、6）。在不改变空腔构型的情况下扩展了探针的共轭体系，有效增强了探针的光学性质，并确保了探针对乙酰胆碱的选择性。2020 年，基于上述机制，Gosse 等人通过将荧光团直接连接到 CTV 单元上优化了探针的光学性质，构建了荧光探针 7。与之前的报道相比，激发和发射波长发生红移，量子产率也有所提高，实现了对乙酰胆碱的定量分析。Jarosz 等人通过将蔗糖基团连接到含有萘的 CTV 结构上构建了荧光探针 8，其中 CTV 单元作为乙酰胆碱结合中心，通过结合蔗糖基团调节空腔构型，萘单元作为荧光团。
血清素的分子探针
5 - 羟色胺（5-HT），又称血清素，是一种吲哚衍生物，属于单胺类神经递质，主要分布于脑干，参与认知功能的调节。研究表明，血清素与抑郁症密切相关。目前临床上使用的主流抗抑郁药物是血清素再摄取抑制剂，它可通过抑制血清素的再摄取来提高神经信号转导效率。醛基作为一种众所周知的亲电试剂，由于其空间位阻小而具有较高的反应活性，常被用于分子荧光探针反应位点的设计。血清素分子中的伯胺基团作为高反应活性单元，具有一定的亲核性，可与醛基缩合形成席夫碱。Glass 等人报道了首个用于血清素检测的近红外荧光探针（9）。该探针以香豆素为荧光母体，醛基为识别位点。通过将 1,2,3,4 - 四氢喹啉与香豆素结合，延长了探针的发射波长。探针与血清素反应后，在 715nm 处实现了荧光增强。策略易受到其他单胺类物质的干扰。Iyer 等人合成了一种菲啶荧光团 10。该荧光团含有醛基，可与血清素的伯胺发生亲核反应形成席夫碱。得益于荧光团优异的光物理性质，如高斯托克斯位移和可观的光稳定性，该探针对血清素具有较高的灵敏度，检测限为 0.31nM。
组胺的分子探针
组胺（HA）是一种含有咪唑基团的单胺类神经递质，由组氨酸脱羧衍生而来。组胺主要分布在下丘脑，同时在外周组织的肥大细胞中广泛分布。组胺被认为是一种自体活性物质，可从肥大细胞释放，参与炎症反应、调节血管通透性等。
亲核取代策略
Bhattacharya 等人报道了基于醛胺缩合反应策略的探针11，用于组胺的荧光检测。组胺分子中的伯胺基团与探针中的醛基反应形成席夫碱，且探针分子中醛基附近的羟基可与组胺的咪唑基团形成氢键，加速了反应速率。该探针还实现了在 RAW264.7 细胞中对组胺的荧光标记。 与血清素类似，组胺也含有具有亲核性的伯胺基团，可作为设计探针的靶点。Chang 等人报道了一种用于标记活嗜碱性粒细胞和巨噬细胞中组胺的荧光中离子酸氟探针 12。该探针本身不发荧光，当与组胺的伯胺反应时，系统会开启荧光。探针 12 对组胺表现出较好的选择性，与其他神经递质和激素相比，其最大荧光增强倍数可达 14 倍。更重要的是，该探针被用于巨噬细胞中组胺摄取和再合成的成像。巨噬细胞中组胺含量不高，探针孵育后无明显荧光变化。当外源性组胺被巨噬细胞摄取时，细胞内荧光强度显著增强。随后，作者使用相关酶抑制剂诱导巨噬细胞再合成组胺，发现探针孵育后细胞的荧光强度明显高于未处理的细胞。探针 12 是标记细胞内组胺的有效工具，但其发射波长较短，极大地限制了其进一步的研究和应用。
金属络合物取代策略
组胺的分子结构与血清素相似但又有所不同，组胺分子中伯胺和咪唑结构的氮原子含有孤对电子，可与金属离子络合。这种独特的分子结构为金属络合物识别提供了基础。金属络合物探针通常由与金属络合的荧光染料构成，在金属离子的作用下，荧光染料的荧光会猝灭。当金属络合物遇到配位能力更强的配体时，金属离子会离开原来的染料，与新的配体络合，导致荧光染料的荧光恢复。 Ojida 等人基于金属络合物取代法设计了一种用于检测组胺的荧光探针。探针 13 以花青染料（Cy5）为母体，在重金属离子 Co（II）的作用下，探针荧光猝灭。加入组胺后，组胺与探针发生竞争性结合，使重金属离子离开，释放荧光信号。该探针进一步修饰后具有细胞膜锚定的特性。将探针靶向 RBL - 2H3 嗜碱性细胞膜后，可观察到明亮的环形图像，加入CoCl2形成络合物后荧光猝灭。作者使用探针 13 检测不同条件诱导的脱颗粒现象，发现探针 13 能够实现非过敏触发诱导的 IgE 非依赖性脱颗粒通过增加内标荧光，比率型荧光探针的准确性得到了极大提高。You 等人报道了一种含金属 Pt 的络合物（探针 14）可与 HA 发生比率响应，加入 HA 后，系统的发射峰从最初的 635nm 移至 567nm。随后，通过对巨噬细胞内源性和外源性 HA 进行成像，验证了探针 14 的生物成像能力。探针 14 成功可视化了细胞内 HA 的摄取过程。
多巴胺的分子探针
作为中枢神经系统中的重要分子，儿茶酚胺神经递质近年来备受关注。儿茶酚胺神经递质是指一类具有儿茶酚结构的神经递质，包括多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素。多巴胺是去甲肾上腺素的前体，由酪氨酸经过两步酶促反应生成。
苯硼酸酯化策略
硼酸基团与顺式二醇的酯化反应早在 180 多年前就被发现。基于此，硼酸基团最初被应用于碳水化合物的研究。随着该研究的发展，硼酸基团已广泛用于分离各种含有顺式二醇的化合物，包括核苷、核酸、碳水化合物和糖蛋白。多巴胺分子含有两个活性基团，一个是伯胺基，另一个是儿茶酚基。儿茶酚又称邻苯二酚，其分子结构中的顺式二醇也能与硼酸基团发生酯化反应。因此，硼酸基团可用于构建多巴胺探针。鉴于多巴胺独特的儿茶酚胺基团和氨基结构，Glass 等人设计并合成了一种含有硼酸基团的香豆素醛作为荧光探针 15，用于检测儿茶酚胺神经递质。探针中的硼酸基团可与儿茶酚基反应形成硼酸酯，香豆素中的醛基可与氨基反应形成席夫碱。由于香豆素中的羰基可与席夫碱形成分子内氢键并生成亚胺离子，探针与儿茶酚胺的反应会使体系产生明显的颜色变化。该探针初步实现了多巴胺的荧光检测，但由于醛基对伯胺的反应活性较高，容易受到其他单胺类物质的干扰。同时，儿茶酚的富电子效应导致探针与多巴胺结合后体系的荧光强度降低，提供了荧光关闭信号，这不利于进一步的研究和应用。 Qin 等人报道了一种基于 BODIY 染料的荧光探针 16，用于多巴胺的检测 。作者使用硼酸基团作为识别位点。同时，将疏水聚合物膜与阳离子交换剂结合，带正电荷的多巴胺被交换进入膜内，并与探针的硼酸基团发生酯化反应，而电中性的儿茶酚无法进入膜内，从而提高了对多巴胺的选择性。此外，该探针在生理 pH 条件下，能够在(10-4M\) 至 (10-2M) 的浓度范围内实现对多巴胺的选择性荧光检测。
亲核开环策略
唑内酯，又称恶唑烷酮，常用于杂环和天然产物的立体选择性合成。由于杂环的特殊分子结构，恶唑烷酮具有一定的亲电性。而多巴胺分子中的氮原子具有孤对电子，有一定的亲核性。因此，高反应活性的恶唑烷酮可作为多巴胺的检测位点。 Zhu 等人报道了一种类似恶唑烷酮的 GFP 荧光探针 17，用于多巴胺的荧光检测。探针 17 分子含有高活性的内酯单元。当向探针体系中加入多巴胺时，多巴胺的伯胺可进攻内酯单元，破坏探针原有的共轭结构，降低体系的荧光，从而实现对多巴胺的荧光检测。虽然该方法初步实现了多巴胺的荧光检测，但极易受到其他单胺类物质的干扰。
金属络合物取代策略
多巴胺分子结构中的儿茶酚基团不仅能与苯硼酸反应生成苯硼酸酯，还因其氧原子含有孤对电子，可作为金属离子和金属络合物的配体，发生配体取代反应。 Yoshio Suzuki 报道了一种 (E)-2,2-(5-(2-(4-(二氰基亚甲基)-6 - 甲基 - 4H - 吡喃 - 2 - 基) 乙烯基)-2 - 羟基苄基) 铁 (II) 二乙酸酯 2 络合物（1 - Fe2+）（探针 18），可作为检测多巴胺的荧光试剂。探针中的氰基吡喃基团作为荧光团，亚氨基二乙酸铁络合物作为荧光猝灭剂和配体交换部分来检测多巴胺。在铁离子存在的情况下，荧光团的荧光被有效猝灭，加入多巴胺后，会与铁离子发生交换反应，从而释放荧光，且荧光强度与多巴胺浓度相关。更重要的是，该探针在选择性测试中对多巴胺表现出良好的选择性，为进一步研究多巴胺提供了良好的工具。与识别血清素的探针类似，该探针虽能检测多巴胺，但体内存在许多与多巴胺结构相似的配体，因此探针还需要进一步优化。
化学反应触发策略
除了分析物与探针分子本身直接反应外，还可利用目标物的化学性质，例如，目标物可触发特定的化学反应，将该化学反应设计到探针结构中，也能实现对目标物的有效识别。 Ho Yu Au - Yeung 等人报道了一种基于儿茶酚胺触发氧化释放荧光的探针 19，。该探针的设计灵感来源于多巴胺 β - 羟化酶的氧化反应。多巴胺 β - 羟化酶是一种含铜氧化酶，可将多巴胺氧化为去甲肾上腺素。基于多巴胺 β - 羟化酶的氧化机制，设计了该探针。该探针由两个\(sp^{2}\)氮和一个硫醚供体支撑的铜（II）络合物与 3 - (2 - 苯并噻唑基)-7 - 羟基香豆素偶联而成。络合物单元模拟了多巴胺 β - 羟化酶的部分结构。当香豆素以醚的形式被笼蔽时，其仅具有微弱的荧光，但 C - O 键断裂后会以酚 / 酚盐的形式释放荧光团，导致荧光开启。有趣的是，该探针将细胞分化形态与细胞内分子含量相关联。PC12 细胞在神经生长因子（NGF）刺激下可分化为类似交感神经节神经元的细胞，细胞内多巴胺合成增加。使用 NGF 刺激细胞后，可观察到细胞出现神经突生长，这是细胞的形态学变化。同时，用该探针孵育细胞后，可观察到细胞内有明显的荧光信号。然而，当细胞内多巴胺合成途径被抑制时，细胞内无明显荧光信号。随后，该探针进一步应用于帕金森病细胞模型中多巴胺的检测，发现帕金森病细胞模型中的多巴胺含量与正常细胞相比显著降低，且细胞形态发生明显变化。该探针不仅能有效标记多巴胺，还将其含量与细胞形态相关联，为在分子水平研究神经元提供了良好的工具。
去甲肾上腺素的分子探针
囊泡中的多巴胺在多巴胺 β- 羟化酶的作用下转化为去甲肾上腺素。中枢神经系统中的去甲肾上腺素广泛分布于蓝斑核，参与调节觉醒、情绪和记忆等生理过程。同时，去甲肾上腺素也存在于肾上腺髓质，并通过酶促反应转化为肾上腺素。
醛胺缩合策略
从分子结构来看，去甲肾上腺素含有两个高活性单元，一个与多巴胺、肾上腺素的儿茶酚单元相同，另一个是 β- 羟乙胺单元。β- 羟乙胺单元中的氨基也是伯胺，可与醛基发生缩合反应。 Glass 等人在之前工作的基础上进一步优化探针设计，报道了一种用于去甲肾上腺素荧光标记的开启型荧光探针 20。该探针仍以醛基作为识别位点，与去甲肾上腺素的伯胺发生缩合反应，导致体系荧光强度发生变化。考虑到仅在体系中引入儿茶酚基团会导致荧光猝灭，作者采用对甲氧基苯基来调节荧光团的发光性质，使探针 20 在与去甲肾上腺素结合后能提供荧光开启信号。因此，作者将探针 20 作为释放囊泡中去甲肾上腺素的特定标记物，用于识别富含去甲肾上腺素和肾上腺素的嗜铬细胞群体。将嗜铬细胞分为两部分：去甲肾上腺素含量升高的细胞和肾上腺素含量升高的细胞。经过测试孵育后，对细胞进行荧光成像，发现去甲肾上腺素含量升高的细胞群体与肾上腺素含量升高的细胞群体相比，呈现出强烈的点状荧光。这些点状荧光与嗜铬细胞的分泌囊泡一致，这也证实了探针与目标物质结合后形成的带电复合物难以穿过囊泡并在囊泡中积累。免疫荧光染色也支持这一结果。 当神经元受到刺激时，细胞动作电位的变化会导致细胞胞吐并分泌神经递质。考虑到神经递质囊泡内外的 pH 差异，Glass 等人继续优化探针，以醛基作为去甲肾上腺素的识别位点，磺酸基作为 pH 敏感位点，构建了一种用于去甲肾上腺素胞吐成像的 “分子逻辑门” 型荧光探针 21。进入细胞后，该探针直接与囊泡中的去甲肾上腺素结合，由于囊泡内的酸性环境（pH 5.0），其荧光保持关闭状态。当细胞发生胞吐时，探针与去甲肾上腺素形成的复合物被释放到突触间隙（pH 7.4），环境 pH 的变化导致复合物的荧光开启。这种基于逻辑门的设计策略依赖于囊泡中高浓度的神经递质以及囊泡与突触间隙之间的 pH 梯度来实现神经递质的胞吐成像，但细胞内大量的伯胺衍生物限制了对特定神经递质的进一步研究。
双位点策略
在探针上为分子的两个活性反应基团设计两个反应位点，通过双位点策略检测去甲肾上腺素。 Glass 等人认为，早期报道的儿茶酚胺探针中硼酸部分与儿茶酚基团结合，醛基与伯胺结合形成胺离子后，富电子的儿茶酚会强烈猝灭体系的荧光。然而，优化后的探针 20 和 21 缺乏硼酸基团，容易受到其他单胺化合物的干扰。因此，作者进一步优化探针，构建了具有更高产率的喹诺酮荧光团的探针 22，有效降低了儿茶酚基团的猝灭效应，并在芳香取代基上添加硼酸，显著增强了对儿茶酚胺结合的亲和力和选择性。由于多巴胺的猝灭效应更强，探针 22 与去甲肾上腺素结合后能比与多巴胺结合提供更强的荧光信号。随后，作者将该探针应用于嗜铬细胞中去甲肾上腺素的胞吐成像。探针 22 与细胞内的去甲肾上腺素结合后，在全内反射荧光显微镜（TIRF）成像下可观察到明显的荧光斑点。然而，当用高浓度钾离子溶液刺激细胞时，可观察到荧光斑点消失，这表明囊泡中的去甲肾上腺素发生了胞吐。作者还使用安培环微电极验证了细胞内荧光斑点的消失是由囊泡内儿茶酚胺的释放引起的。这为在细胞水平监测神经递质的生理活性提供了新的途径。 鉴于探针发射波长达到近红外区域可提高其在组织成像中的应用效果，Glass 等人在探针 21 和探针 22 的基础上继续优化探针的光学性能，构建了具有近红外发射波长的去甲肾上腺素检测探针 23。同样，该探针也标记了活细胞中富含去甲肾上腺素的囊泡。Tian 等人报道的探针 25 具有三重识别功能，可分别对多种神经递质做出响应。这种多识别功能的实现依赖于多个识别位点的构建。该探针同时使用香豆素和萘酰亚胺作为荧光团，在香豆素部分修饰醛基，可与单胺类神经递质的伯胺发生缩合反应生成席夫碱。在萘酰亚胺部分，硼酸基团与儿茶酚胺神经递质的儿茶酚基团发生缩合反应。香豆素单元和萘酰亚胺单元连接到荧光柱芳烃上，探针的富电子空腔可通过静电相互作用对带电神经递质做出响应。虽然这种三联体探针设计策略为神经递质的高通量阵列识别提供了新方法，但特定神经递质的具体检测性能仍需进一步优化。
“保护 - 去保护” 策略
“保护 - 去保护” 策略，顾名思义，首先对荧光团的一个基团进行保护以猝灭荧光信号，然后通过与分析物的特定反应释放该基团，使荧光信号得以恢复。尽管去甲肾上腺素的结构与多巴胺和肾上腺素非常相似，但它具有独特的 β- 羟乙胺结构，包含两个具有不同亲核能力的基团，这为设计二级亲核反应位点提供了前提条件。长期以来，很难区分结构和性质相似的三种儿茶酚胺神经递质（多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素）。2019 年，针对去甲肾上腺素独特的 β- 羟乙胺结构，我们团队首次提出级联亲核取代反应作为特异性去甲肾上腺素荧光探针的设计策略，并报道了荧光探针 26 用于脑组织中去甲肾上腺素的特异性标记。
该策略也可称为 “保护 - 去保护” 策略。其核心是通过羰基酯基将离去基团与荧光团配对，保护荧光团的羟基并猝灭其荧光。去甲肾上腺素中具有强亲核性的伯胺基团首先与探针发生亲核取代反应，导致离去基团释放，然后 β 位羟基与上述化合物发生分子内亲核取代反应，生成稳定的五元环内酯化合物，暴露荧光团羟基并释放荧光。显然，多巴胺和肾上腺素无法发生这样的反应。探针 26 用于脑组织的免疫荧光共染色研究。探针染色区域仅与去甲肾上腺素免疫荧光标记区域重叠，与其他两种儿茶酚胺神经递质没有明显重叠，表明探针 26 实现了脑组织中去甲肾上腺素的特异性标记。
“狩猎 - 射击” 策略
“狩猎 - 射击” 策略聚焦于去甲肾上腺素独特的 β- 羟乙胺结构。其先进之处在于，它首先通过快速反应使分析物分子靠近，将分子间反应转化为分子内反应，随后进行第二次亲核反应。 最近，我们团队提出了一种新的 “狩猎 - 射击” 策略，构建了在出口位点修饰醛基的探针 34。高反应活性的醛基首先与去甲肾上腺素 β- 羟乙胺单元的伯胺基团发生亲核反应，然后相邻的醛基与上述产物发生亲核反应生成五酰亚胺。此时，五元环中的 NH 基团仍可与相邻的酯基反应并释放荧光团。该策略能够快速、特异性地检测去甲肾上腺素。在细胞成像中，探针 34 成功捕获了去甲肾上腺素的释放 - 再摄取过程。重要的是，通过在荧光团中引入卤素并增加探针的脂溶性以调节\(pK_{a}\)，该探针成功穿透了血脑屏障（BBB）。使用探针 34 对正常小鼠和癫痫小鼠模型进行体内成像，发现癫痫小鼠模型中去甲肾上腺素的分布和水平发生了变化。这一策略的有效应用不仅为去甲肾上腺素的特异性标记提供了新思路，对血脑屏障穿透性探针的设计也具有重要意义 [101]。该策略在去甲肾上腺素的识别方面具有创新性，有效地捕获了分析物并拉近了反应物之间的距离，从而有效加快了反应速率。这为荧光探针的构建提供了一些启示，即通过反应将分子间事件转化为分子内事件有助于提高探针的选择性并加快反应速率。
双键加成策略
我们团队在构建去甲肾上腺素比率荧光探针 37 时发现，去甲肾上腺素可与吡喃盐单元快速反应。随后使用探针 35 和探针 36 研究去甲肾上腺素与吡喃盐的识别机制。通过核磁滴定实验发现，去甲肾上腺素可与吡喃盐的高活性双键快速反应。随后，使用探针 36 评估嗜铬细胞瘤发展过程中去甲肾上腺素水平波动的可视化效果 。尽管吡喃盐通常被视为二氧化硫的识别位点，但其与去甲肾上腺素的快速反应为识别去甲肾上腺素提供了新途径，例如通过修饰碳 - 碳双键来调节其反应性，以实现对去甲肾上腺素的特异性检测。
谷氨酸的分子探针
谷氨酸不仅作为一种氨基酸参与蛋白质代谢，还作为神经递质参与神经信号传导。谷氨酸是一种兴奋性神经递质，参与学习、记忆等生理活动的调节。
“逻辑门” 策略
双锁逻辑门探针广泛用于测量两种相互独立或相互依赖但只有一个信号输出的不同分析物。双锁逻辑门探针通常有两个不同的识别位点，可与两种分析物发生反应，只有当两个反应都发生时，探针才会输出信号，有效避免了假阳性信号，从而提高了荧光探针的准确性。
最初，Glass 等人报道了一种用于构建谷氨酸探针 38 的双输入逻辑门策略。在只有谷氨酸或锌离子存在时，探针没有荧光，但当两者同时存在时，谷氨酸首先与探针的醛基反应生成席夫碱，然后迅速与锌离子络合，引起荧光变化，从而实现对谷氨酸的识别。神经递质最初存储在 pH 为 5.0 的囊泡中，但当神经递质释放到 pH 为 7.4 的突触间隙时，该研究小组针对这一生理过程继续优化探针，将双逻辑门策略发展为三输入与门逻辑门策略，并构建了探针 39，即只有当谷氨酸、锌离子和 pH 变化同时存在时，才会引起探针荧光的变化。这种逻辑门策略为神经递质的动态监测提供了新思路。
质子化策略
Patra 等人合成了一种简单的席夫碱（探针 40）作为谷氨酸检测探针。该探针结构中有两个席夫碱单元。加入谷氨酸后，席夫碱单元上的氮原子发生质子化，导致体系的吸收发生明显变化。因此，该探针实现了对谷氨酸的比色检测。
醛胺缩合策略
谷氨酸的氨基也具有一定的亲核性，可与醛基发生缩合反应。Pu 等人基于此报道了一种具有二醛结构的探针 41，用于谷氨酸的识别，。由于两个醛基距离较近，它们相互协作实现了对谷氨酸的选择性识别。
亚胺复分解策略
Liu 等人报道了一种以 BODIPY 为母体、以磷酸吡哆醛为识别位点的荧光探针 42，用于在水溶液中检测手性谷氨酸。探针分子中的手性环己烷作为 BODIPY 荧光团与磷酸吡哆醛衍生物之间的连接基团，同时也是氨基酸的手性控制中心。探针与谷氨酸之间的反应机制是亚胺复分解反应。反应后，探针体系的光致电子转移（PET）过程关闭，从而释放荧光，实现对谷氨酸的荧光检测。该探针还可用于 4T1 细胞中 D - 谷氨酸的成像。
氢键策略
Susanta Adhikari 等人合成了一种可用于识别谷氨酸的 BODIPY 染料（探针 43），该染料本身存在 PET 过程，因此体系中没有明显荧光。加入谷氨酸后，由于氢键作用，PET 过程被中断，染料释放荧光，实现对谷氨酸的荧光检测 。
三磷酸腺苷的分子探针
三磷酸腺苷（ATP）作为一种能量分子广为人知。ATP 在某些神经节细胞中充当神经递质，完成神经信号传导，并参与多种感觉的感知。例如，当组织受损时，ATP 会被释放以完成疼痛信号的传递。在用于检测 ATP 的荧光探针构建中，ATP 既可以作为荧光团，也能作为相应的识别位点。基于此，邹等人报道了一种比率型荧光探针 44，它由萘二甲酰亚胺供体和罗丹明受体组成。当加入 ATP 时，罗丹明螺环打开，接收来自萘二甲酰亚胺的能量并发出荧光 。同样，李等人报道了一种具有线粒体靶向特性的 ATP 荧光探针 45。该探针也选择罗丹明作为母体，并将线粒体定位基团三苯基膦有机连接起来构建荧光探针。最后，作者使用该探针监测线粒体中 ATP 水平的波动 。Kyo Han Ahn 等人构建了一种含有金属络合物的荧光探针 46，用于检测 ATP。ATP 分子中含有氧原子的磷酸基团可以与探针中的(Zn2+)络合。同时，ATP 分子中的核苷酸单元也能与探针中的萘发生 π - π 堆积作用。在静电相互作用和电子堆积的双重作用下实现了对 ATP 的荧光检测。可视化细胞器之间相互作用的动态过程对于揭示相关生理和病理过程具有重要意义。Kyo Han Ahn 等人设计了一种具有双光子效应的比率荧光探针 47，用于 ATP 标记，并通过标记溶酶体囊泡中的 ATP 可视化两个溶酶体的融合过程。在探针设计中，罗丹明衍生物作为 ATP 识别位点和荧光受体，BODIPY 作为荧光供体和双光子骨架。当探针与 ATP 反应时，由于荧光共振能量转移（FRET），BODIPY 的能量转移到罗丹明衍生物上，导致体系原本的蓝色荧光减弱，黄色荧光增强。该探针成功用于监测两个溶酶体之间的融合过程，并揭示了不同融合机制下 ATP 的不同变化。
气体信号分子的分子探针
一氧化氮
作为生物活性分子，硫化氢和一氧化氮不仅参与维持正常的生理内环境稳定，还作为气体信号分子参与调节血压、心率等多种生理过程。鉴于硫化氢和一氧化氮已广为人知，本节将不详细阐述它们的生物合成过程，而是重点总结硫化氢和一氧化氮的识别机制。郭等人巧妙地使用 N - 苄基 - 4 - 羟基苯胺作为探针 51 的反应位点（，在有氧条件下，该位点可与一氧化氮发生硝化反应，实现对一氧化氮的高灵敏度和快速响应 。此外，对该探针进行了进一步修饰，添加了线粒体靶向功能，以实现巨噬细胞中一氧化氮的可视化标记。同样，刘等人报道了一种具有近红外发射的一氧化氮探针 52。该探针以硅罗丹明为骨架，仲胺为反应位点。在耗氧条件下，一氧化氮与探针中的氨基发生硝化反应，实际上阻碍了光致电子转移（PET）过程，提高了体系的荧光强度。2022 年，郑的研究团队详细介绍了一种三通道荧光探针 53，它可同时识别一氧化氮和谷胱甘肽（GSH），以评估射血分数保留的心力衰竭（HFPEF）中的心血管氧化和硝化应激。通过对 GSH 和 NO 的非侵入性可视化，实现了对正常心脏和 HFPEF 心脏的有效区分 。
硫化氢
硫化氢被认为比其他含巯基的生物硫醇（半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽）具有更强的亲核性，因此亲核反应被认为是硫化氢识别策略中的有效方法。张等人报道了一种用于硫化氢原位检测和成像的香豆素衍生物（探针 54），探针分子中 2,4 - 二硝基苯基的强吸电子作用导致荧光猝灭。当亲核性的硫化氢与之反应时，DNP 离去，导致荧光恢复。该探针成功用于不同细胞系中硫化氢的检测，并进一步有效地对斑马鱼肠道和肝脏中硫化氢的分布进行成像。同样，NBD 常用于构建硫化氢识别探针 55 。冼的研究小组提出了第一种基于二硫键的用于特异性识别硫化氢的探针 56，并基于硫化氢的亲核性提出了一种针对 S - S 键的双亲核反应方法。该探针在接触硫化氢时表现出优异的灵敏度和选择性。该团队对探针进行了进一步优化，创建了一系列用于体内和细胞内硫化氢成像的探针。硫化氢不仅具有亲核性，还具有还原性，能够将叠氮化合物还原为氨基化合物。利用这一特性，设计了一种用于识别硫化氢的萘二甲酰亚胺衍生物（57），探针中的叠氮基团可被硫化氢高效还原为氨基，随后释放荧光。该探针还可以定位在溶酶体中，实现了在亚细胞器水平对硫化氢的荧光标记。Kyo Han Ahn 等人合成了对H2S具有特异性响应的探针 58。具有双光子性质的萘被用作荧光团，通过将 α,β-不饱和酮与醛基连接构建了该探针。H2S首先与醛基反应形成中间产物，然后发生分子内迈克尔加成反应，形成稳定的五环化合物。这种策略依靠甲氧基引起的空间位阻和电子效应实现了对H2S的特异性识别。
结论与展望
尽管目前报道的探针已经取得了很大进展，但更深入的研究对探针性能提出了更高的要求：（1）面对复杂的生物系统和神经递质的快速动态变化，探针的选择性和灵敏度需要不断优化。这就要求研究人员开发新的识别位点或优化现有的识别位点。（2）大脑中仍有许多值得检测的活性分子，如具有神经递质功能的小分子肽、参与神经递质代谢的单胺氧化酶、乙酰胆碱酯酶等。研究人员应继续拓展探针的应用领域，建立更全面的分子识别探针库。（3）神经递质主要存在于大脑中，而大脑中存在的血脑屏障一直是当前大脑研究的主要障碍，如何有效穿透血脑屏障并揭示其规律也是一个亟待解决的重大问题。
参考文献
Advances neurotransmitter fluorescent probe based on chemical reaction or molecular assemble and its neuroimaging， Na Zhou, Fangjun Huo * , Caixia Yin*，Coord. Chem. Rev. 518 (2024) 216062，https://doi.org/10.1016/j.ccr.2025.216480
