内容提要
本研究设计了一种发射NIR-II的焦亡生物调谐器Rd-TTPA，在超声照射下诱导焦亡，以实现肿瘤的焦亡增强声动力治疗（SDT）和免疫原性细胞死亡（ICD）。得益于其A-π-D1-D2结构增强的供体-受体相互作用，Rd-TTPA在超声照射下都能快速产生超氧自由基（O2-•），从而在常氧（21% O2）和缺氧（2% O2）条件下诱导细胞焦亡。声动力生物调谐器克服了化学药物和光敏剂长期存在的耐药和穿透深度有限的缺点。深入研究表明，Rd-TTPA可以选择性靶向肿瘤细胞线粒体，并具有出色的体内NIR-II荧光成像能力。用Rd-TPPA给药荷瘤小鼠模型，在NIR-II荧光成像的指导下，通过焦热增强SDT达到满意的抗肿瘤效果。
Rd-TTPA的合成和ROS生成
我们合成并研究了具有典型的“A-π-D”型三苯胺单给体结构的对照物Rd-TPA。首先利用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱研究了Rd-TTPA和Rd-TPA的光学性质。这两种化合物在不同极性溶剂中均表现出稳定的吸收（λabs = 635-680）和发射光谱（λem = 975nm）。Rd-TTPA在DMF中在660 nm处有最大吸收带，在1000 nm处有最大荧光发射带。Rd-TPA的吸收最大值为358nm，发射最大值为451nm。与Rd-TPA相比，Rd-TTPA在1000 nm处表现出更长的NIR-II荧光发射带，并具有340 nm的巨大Stokes位移。大Stokes位移可以有效消除荧光探针自吸收引起的荧光猝灭现象以及激发光谱与荧光光谱之间的串扰，提高探针的荧光成像信噪比（SNR），更有利于在生物成像中的应用。我们还测定了Rd-TTPA在PBS中的吸收和发射光谱。Rd-TTPA在PBS中的吸收和发射峰分别位于630 nm和940 nm处。计算出Rd-TTPA的摩尔消光系数为3640 M-1 cm-1，表明Rd-TTPA在660 nm处具有一定的吸收能力。参考近红外染料IR-26（在二氯乙烷中QY = 0.05%）计算，Rd-TTPA在二氯乙烷中NIR- II荧光量子产率（QY）高达1.22%，表明Rd-TTPA在NIR- II窗口具有优异的成像能力。我们通过测量PBS中紫外-可见吸收和荧光强度的变化来评估Rd-TTPA的溶解度。通过测量Rd-TTPA在光照射下的荧光强度变化来评价其光稳定性。与市售的NIR-II荧光染料IR-26相比，Rd-TTPA在红光照射30分钟后荧光强度没有明显下降，表明其具有优异的光稳定性。
我们评估了Rd-TTPA在超声（3.0 MHz, 1.0 W/cm2）照射下产生ROS的能力。使用DCFH作为溶液中的ROS荧光探针进行初步评估。在Rd-TTPA超声照射下，DCFH在530 nm处的荧光强度值随着时间的增加（0-10 min）增加了约5.8倍，是相同条件下Rd-TPA的2.0倍，超过了商用声敏剂亚甲基蓝。相比之下，超声照射下DCFH水溶液（H2O）的荧光强度在0 - 600s内保持相对不变。此外，我们还以DHR 123作为O2-•的指示剂和ABDA作为1O2的指示剂，测定了Rd-TTPA是否能产生超氧自由基（O2-•）或单线态氧（1O2）。我们惊奇地发现，在超声照射（3.0 MHz, 1.0 W/cm2）下，Rd-TTPA处理的DHR 123的荧光强度（535 nm）随着照射时间的变化增加了近8.5倍，而ABDA在380 nm处的UV-Vis吸收值没有明显变化。而且，相对于单独的DHR123，即使在360 s的较短曝光时间内，Rd-TTPA的荧光增强也达到了7.5倍左右。考虑到这些发现，它支持Rd-TTPA在超声照射下特别能产生O2-•，但不能产生1O2。我们推测，Rd-TTPA可以吸收声子产生激发态（1 [Rd-TTPA*]），并通过系统间交叉（ISC）形成相应的三重态（3 [Rd-TTPA*]），然后三态分子通过i型电子传递途径将电子转移到分子氧中产生O2-•。还应该强调的是，基于声敏剂的O2-•发生器可以降低SDT对氧的依赖，增强肿瘤的治疗指数，这是由于O2-•涉及Haber-Weiss /Fenton反应。
我们还使用2 ',7 ' -二氯荧光素（DCFH-DA）评估了Rd-TTPA在细胞中产生ROS的能力，DCFH-DA可以在ROS存在下被细胞内酯酶立即分解并氧化成2 ',7 ' -二氯荧光素（DCF）。RdTTPA在488 nm处没有明显的吸收，其荧光强度远弱于在相同波长488 nm处激发的DCF。这些结果表明，Rd-TTPA不会干扰细胞内DCF的绿色荧光信号。，在Rd-TTPA存在的情况下，4T1细胞在超声照射下出现亮绿色荧光信号，荧光强度是Rd-TTPA组的8.1倍，是US组的6.2倍，说明RdTTPA具有优异的声动力性能，为后续的细胞和体内研究提供了前提条件，流式细胞术进一步验证了这一点。此外，在细胞超声照射下，Rd-TTPA还被发现是O2-•的发生器，而不是1O2。在激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）下，对经rt - ttpa处理和超声照射的4T1细胞，观察到双氢乙二酸（DHE，细胞O2-•的指标）的特征性红色荧光。而Rd-TTPA组和US照射组均未观察到明显的红色荧光信号。用单线态氧传感器绿色（SOSG）探针在4T1细胞中进行了类似的研究，显示1O2的产生，没有出现明显的绿色荧光，表明在超声照射下，经rp - ttpa处理的细胞没有产生1O2。结果证实，Rd-TTPA是一种声动力超氧自由基发生器。
Rd-TTPA体外抗肿瘤效果的研究
线粒体不仅是细胞的能量补给站，也是产生活性氧的主要储存库。研究表明，肿瘤细胞的线粒体膜电位（ΔΨm） （~-220 mV）高于正常细胞（~-140 mV），使带正电的阳离子分子如罗丹明123和三苯磷（TPP+）选择性靶向肿瘤线粒体。此外，疏水分子结构增强了穿越线粒体膜的能力。考虑到这一点，我们探索了带正电的阳离子探针Rd-TTPA是否可以有效地靶向线粒体产生ROS，从而导致线粒体功能障碍，提高治疗效率。4T1细胞用Rd-TTPA、Mito-Tracker Green （MTG，一种商用线粒体染料）或Lyso-Tracker Green （LTG，一种商用溶酶体染料）和Hoechst 33342处理。Rd-TTPA的红色通道荧光与MTG的绿色荧光融合良好，而Hoechst 33342的蓝色荧光仅染色细胞核。Rd-TTPA与MTG的Pearson系数为0.90，而Rd-TTPA与Hoechst 33342的Pearson系数为0.13，表明探针主要针对线粒体。相比之下，Rd-TTPA与LTG的Pearson系数仅为0.57，证实了Rd-TTPA靶向线粒体的潜力。
采用MTT法评价Rd-TTPA体外抗肿瘤作用。在没有超声照射的情况下，Rd-TTPA的毒性可以忽略不计，当Rd-TTPA浓度升至30 μM时，细胞存活率仍可达到90%。但在超声照射下，随着Rd-TTPA浓度的增加，4T1细胞的活性降低。Rd-TTPA + US组IC50值为7.88 μM。此外，我们通过活细胞和死细胞染色（Calcein-AM和PI）结果证明，Rd-TTPA具有良好的体外抗肿瘤活性。包括Rd-TTPA组和US组在内的对照组只出现绿色荧光信号，说明Rd-TTPA的细胞毒性可以忽略不计，超声照射对细胞活力的影响也不显著。然而，Rd-TTPA + US组中有一半的细胞表现出强烈的红色荧光信号，而绿色荧光信号却极度减弱，这表明Rd-TTPA可以作为一种有效的声敏剂来导致细胞死亡。这些结果证明，Rd-TTPA在细胞内具有良好的声动力抗肿瘤活性。
SDT触发细胞焦亡的研究
在声动力治疗过程中，Rd-TTPA是否能诱导细胞焦亡还有待进一步验证。为此，我们首先使用LSCM观察Rd-TTPA孵育4T1细胞在超声照射下的形态学变化。超声照射10分钟后，发现只有经Rd-TTPA处理的4T1细胞形成了一些泡状突起，这些突起由细胞质膜染色染料DIO染色而成。Hoechst 33342染色结果显示，细胞核在这个过程中保持完整，而不是分裂（细胞凋亡的一个标志），与细胞焦亡的典型特征一致。相比之下，对照细胞，仅用Rd-TTPA或超声照射的细胞未发现泡状突起。因此，我们认为Rd-TTPA可以作为SDT下的焦亡生物调谐器。为了进一步揭示焦亡激活途径，我们对不同处理的4T1细胞进行了Western blot分析。Caspase-1/ Gasdermin-D （GSDMD）被认为是引发焦亡的主要途径。因此，我们试图探索是否也通过caspase-1/GSDMD途径调节sd诱导的焦亡。caspase-1和GSDMD-N片段的表达水平在Rd-TTPA + US组有显著性差异，而在对照组、Rd-TTPA组和US组无显著性差异。Western blot结果支持了我们的假设，即超声诱导O2•产生通过caspase- 1/GSDMD途径初始化细胞热亡。由于焦亡过程中产生的GSDMD-N可触发膜孔的形成，导致IL-1β等炎性细胞因子的释放，因此测量各组细胞培养基中IL-1β的相对释放量。Rd-TTPA + US组的IL-1β含量高于其他组，这与gsdmd触发细胞膜孔的预期一致。
体外缺氧条件下的抗肿瘤作用
肿瘤缺氧可增强肿瘤对基于ros的肿瘤治疗如PDT和SDT的抵抗，导致无效的治疗结果bbb。因此，通过在三气培养箱中使用缺氧条件模拟肿瘤缺氧微环境，我们试图评估Rd-TTPA是否可以在缺氧条件下诱导焦亡并介导抗肿瘤作用（2% O2）。DCFH-DA用于评价Rd-TTPA在低氧条件下（氧含量为2%）产生ROS的能力。低氧4T1细胞经Rd-TTPA孵育后，DCF的绿色荧光特征明显，而其他各组无明显变化。此外，通过DHE染色也评估了Rd-TTPA在缺氧条件下产生O2-•的能力。超声照射后，低氧负载rd - ttpa的4T1细胞呈现鲜红色荧光，而其他组显示较少红色荧光。这些低氧SDT结果与Rd-TTPA在常压条件下的ROS生成情况一致，证明了Rd-TTPA通过O2依赖性SDT作用于低氧肿瘤的可行性。采用MTT法评价Rd-TTPA的抗肿瘤效果。在缺氧条件下，Rd-TTPA对4T1细胞的细胞毒性可以忽略不计。超声照射下，Rd-TTPA在低氧（2% O2）条件下表现出剂量依赖的癌细胞清除作用，IC50值（最大抑制浓度的一半）为9.92 μM，仅略低于正常氧条件下的IC50值（21% O2下的IC50 = 7.88 μM）。随后，活/死细胞染色更直观地证实了Rd-TTPA对缺氧条件下的4T1细胞具有良好的杀伤作用。为探讨RdTTPA是否能有效激活缺氧条件下的焦亡，采用LSCM观察细胞形态学变化。在超声照射下，Rd-TTPA孵育的缺氧4T1细胞表现出明显的细胞形态学变化，包括细胞膜裂解和焦亡体形成，这与常氧条件下的焦亡特征相似。因此，我们得出结论，Rd-TTPA即使在缺氧环境下也能诱导焦亡，这可能是由于基于sdt的O2•发生器和焦亡诱导剂Rd-TTPA在超声照射下通过不依赖于O2的治疗途径产生O2•。Rd-TTPA的这种独特属性使其成为治疗深部和缺氧肿瘤的一种有价值的治疗方法。
体内NIR-II成像引导的SDT
鉴于Rd-TTPA在体外具有优异的NIR-II荧光发射，我们利用NIR-II体内成像系统研究了RdTTPA在肿瘤中的积累和体内成像能力。首先，在小鼠肿瘤内注射Rd-TTPA 0-48 h后，在1000 nm长通（LP）通道上几乎没有明显的荧光变化，表明其具有良好的NIR-II成像能力和在肿瘤中Rd-TTPA的滞留时间长。静脉给药Rd-TTPA后，肿瘤部位的NIR-II荧光亮度随时间升高，在8 h时达到最大强度，96 h时荧光信号依然明亮活体实验结果表明，Rd-TTPA能靶向并集中于肿瘤内，具有较长的肿瘤滞留时间（约96小时），这有利于活体小鼠的特异性NIR-II荧光成像和成像引导下的SDT。鉴于Rd-TTPA在细胞和体内的优异表现，我们进一步通过焦热增强SDT对4T1荷瘤小鼠的抗肿瘤作用进行了验证。首先，通过向雌性BALB/c小鼠右后肢皮下注射4T1细胞，建立4T1荷瘤模型。然后，每2天给荷瘤小鼠不同的处理：(i) PBS, (ii) Rd-TTPA, (iii) US, (iv) Rd-TTPA + US，监测并记录肿瘤体积，持续14天。SDT治疗14天后，Rd-TTPA + US组皮下肿瘤未见明显生长，而其他组肿瘤体积明显增大，表明Rd-TTPA可有效抑制SDT对肿瘤生长的抑制。同时，各组荷瘤小鼠在不同治疗14天后体重无明显变化，表明Rd-TTPA不影响小鼠的生存和生长。随后，我们通过组织学研究证实了RdTTPA的抗肿瘤作用。肿瘤组织切片苏木精和伊红（H&E）染色显示，对照组和另外两组（Rd-TTPA单独组和US单独组）的细胞形态正常，而Rd-TTPA + US组的肿瘤细胞被明显破坏，表明基于Rd-TTPA的SDT具有出色的抗肿瘤能力，Ki-67染色进一步证实了这一点。
总结
我们构建了具有NIR-II发射的小分子焦亡生物调谐器RdTTPA，在NIR-II荧光成像的指导下实现焦亡增强的声动力肿瘤治疗。A-π-D1-D2型结构增强了供体-受体相互作用，有利于Rd-TTPA分子内电荷转移和三重态形成，提高了其声动力和NIR-II荧光性能。在超声照射下，Rd-TTPA通过大量O2-•产生诱导肿瘤细胞焦亡。Western Blot研究进一步揭示了Rd-TTPA介导的焦亡机制涉及Caspase-1/GSDMD通路。即使在低氧条件下（2% O2）， Rd-TTPA也能诱导焦亡并有效消融肿瘤细胞，表明sdt介导的焦亡是低氧依赖性的。在体内肿瘤治疗中，Rd-TTPA通过焦热增强的SDT和ICD显示了良好的抗肿瘤作用。因此，本研究为设计一种声动力生物调谐器来激活NIR-II成像引导的SDT对实体肿瘤的焦亡提供了一种有希望的策略，并将推动新型声敏剂在肿瘤治疗中的开发和应用。
参考文献
A NIR-II emissive sonosensitized biotuner for pyroptosis-enhanced sonodynamic therapy of hypoxic tumors，Xiaoyu Wang，Fan Zhang, Weijie Chi**，Zhiqiang Mao, Jiao Wu***, Jingwen Zou, Jong Seung Kim， Biomaterials 315 (2025) 122969 ，https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2024.122969
