内容提要
单线态氧(1O2)是一种很好的肿瘤治疗活性氧(ROS)，近年来受到广泛关注。然而，在以缺氧为特征的实体瘤中，低氧含量阻碍了其产生。我们提出了一种由人血清白蛋白(MnClPc@HSA)包裹的锰(III)酞菁复合物(MnClPc)组成的新型纳米组装体。MnClPc@HSA作为常规的声敏剂，在超声刺激(US)下促进O2转化为1O2。此外，MnClPc@HSA使肿瘤内内源性过氧化氢(H2O2)转化为超氧自由基(·O2-)和1O2，并被US进一步增强。这种通过MnClPc@HSA产生的不依赖于O2的多种ROS克服了肿瘤缺氧的限制，同时诱导免疫原性细胞死亡(ICD)并增强T细胞的浸润。在4 T1荷瘤小鼠双侧肿瘤模型中，该方法与常规PD-L1免疫治疗联合使用，可有效抑制远端和肺转移性肿瘤的增殖，同时消除原发肿瘤。
结果与讨论
MnClPc@HSA NPs的合成与表征
由于HSA具有较高的生物相容性，因此应用HSA包封MnClPc复合物。我们获得了分散良好且形状均匀的MnClPc@HSA NPs，其水动力直径为~122 nm。此外，MnClPc@HSA NPs在各种条件下都具有良好的结构稳定性，在溶液中储存8天以上，直径和zeta电位的变化可以忽略不计。与MnClPc (~806 nm)相比，MnClPc@HSA的最大吸收波长(~848 nm)发生了红移，这可能是由于j形聚集的形成引起的。紫外-可见-近红外吸收光谱定量测定MnClPc@HSA NPs的包封效率(EE)为65±1.5%，MnClPc有效浓度为0.248 mg/mL。
MnClPc@HSA NPs的声动力和化学动力学特性
在60分钟的超声处理过程中，吸收度的变化可以忽略不计，这证明了MnClPc@HSA NPs优异的超声稳定性。我们使用9,10-蒽-双(亚甲基)丙二酸(ABDA)作为指标来监测1O2的生成并评估MnClPc@HSA NPs的声动力性能。在MnClPc@HSA NPs + US组，30分钟后ABDA的FL强度下降了24%，表示1O2的生成。更有趣的是，在没有US处理的情况下，仅在NPs + H2O2存在的情况下，我们还观察到29%的FL强度降低，提示发生了一个化学动力学过程。在NPs + H2O2 + US组中观察到FL的快速衰减，最终下降64%，通过超声增强化学动力学治疗提示1O2产生的爆发，通过NaN3的抑制实验进一步证实了1O2的产生。
为了研究1O2的产生机制，我们进行了电子自旋共振(ESR)实验。当MnClPc@HSA和H2O2混合或使用MnClPc@HSA NPs作为声敏剂时，在US暴露下，可以观察到1种O2的明显特征峰。重要的是，当MnClPc@HSA和H2O2的混合物被US照射时，1O2的特征峰明显变强。有趣的是，我们证明了MnClPc@HSA NPs + H2O2组产生·O2-，从2-叔丁基羰基-2-甲基-3,4-二氢- 2hpyrro -1-氧化物(BMPO)捕获的特征峰可以看出。在MnClPc@HSA NPs + H2O2组中，US照射10 min后，·O2-峰逐渐变强，随着US照射时间增加至30 min，峰逐渐消失。这可能是由于·O2-是生成1O2的中间物质，US处理加速了·O2-向1O2的转化。我们在系统中引入了苯醌(BQ)作为·O2-清除剂。我们在NPs + H2O2 + BQ组中没有观察到1O2的生成，说明在1O2的生成过程中不可缺少·O2-，推断NPs与H2O2的化学反应是通过·O2-的途径产生1O2的。同时用N2除去溶解氧，阻断SDT过程。我们证明了NPs + H2O2 + US-N2组中1O2的生成(38.3%)明显高于NPs + H2O2组(28.9%)，表明US刺激大大加速了化学动力学过程。这种实验设置确保了ROS在缺氧条件下的生成，为在缺氧条件下的体内肿瘤治疗提供了可能。相反，在NPs + H2O2 + US + BQ组，其中·O2-被BQ清除，只发生sdt诱导的1O2产生，1O2产生(24.9%)与NPs + US组的观察结果相当(23.5%)。
我们还使用DHR123检测·O2-的生成，NPs + H2O2组中FL的逐渐增加表明在50 min内持续产生·O2-。NPs + US + H2O2组前10 min的FL强度明显增加了15.6倍，远高于NPs + H2O2组(4.7倍)。然而，在接下来的40分钟内，它几乎保持不变，提示没有产生新的超氧阴离子，进一步证明超声促进了·O2-向1O2的转化。在此过程中，MnIII 2p1/2和2p3/2峰(653.05和641.16 eV)与H2O2反应前后结合能的变化可以忽略不计，证实了MnClPc@HSA的催化作用。综上所述，MnClPc@HSA-stimulated SDT和MnClPc@HSA-mediated CDT在有氧或无氧的情况下均可产生多种ROS的积累，为后续体内外肿瘤治疗奠定了基础。
MnClPc@HSA体外SDT&CDT治疗
然后将纳米系统应用于4 T1乳腺癌细胞的体外治疗。MnClPc@HSA NPs在培养4小时内被癌细胞迅速内化，通过电感耦合等离子体(ICP)证实。随后，为了探索MnClPc@HSA杀死肿瘤细胞的潜在机制，我们在常氧(21% O2)和低氧(1% O2)条件下测试了细胞内ROS的产生。NPs单独处理后，4个T1细胞检测到微弱的1O2信号。正如预期的那样，SDT效果受到O2含量的影响，这可以从低氧组单线态氧传感器绿色试剂(SOSG)的FL强度较常氧组降低中看出。缺氧和常氧条件下产生1O2的差异是由于缺氧条件下SDT过程的抑制。经H2O2预处理的肿瘤细胞产生1O2的能力增强，这主要是由于H2O2与Mn(III)的反应。最终，定量分析显示，NPs + H2O2 + US组与未处理的对照组相比，在常氧和缺氧条件下，FL强度分别增加了3.9倍和2.9倍。
基于上述反应机理，采用双氢乙啶(DHE)作为·O2-指示剂，与·O2-特异反应，荧光发射增强。在常氧和缺氧条件下，MnClPc@HSA NPs处理的细胞都能观察到明亮的红色荧光，而H2O2和US的联合对其有很强的刺激作用。定量测试显示，NPs + H2O2 + US组的强度在正常氧条件下是NPs组的1.6倍，在缺氧条件下是1.8倍，这可能是由于缺氧环境中H2O2浓度较高。
同样，对于ROS试剂盒2,7 -二氯氟escin diacetate (DCFH-DA)荧光，US刺激的增强作用仅在常氧条件下可见，而在缺氧条件下H2O2的响应更为明显。定量结果显示，在O2充足条件下，NPs + H2O2 + US组的强度比对照组增加了75.9倍，在O2缺乏条件下增加了77.5倍。考虑到1O2产率相对较低，但缺氧条件下·O2-增强，ROS总量没有显著差异，表明ROS的富集与O2无关。
4 T1细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的凋亡率随MnClPc@HSA浓度的增加均无明显变化，表明其具有良好的生物相容性。在US (1 W/cm2, 5 min)照射下，该化合物对常氧下4个T1细胞有明显的细胞毒作用，半数最大抑制浓度(IC50)为143.8 μM。因此，我们选择100 μM的浓度来探讨常氧和缺氧对不同处理的影响。在缺氧情况下，MnClPc@HSA NPs几乎没有声动力毒性，而H2O2和MnClPc@HSA处理的细胞表现出47.1%的细胞活力下降，而在富氧环境下下降36.6%。综上所述，在NPs + H2O2 + US组中，MnClPc@HSA-augmented SDT&CDT对肿瘤细胞的增殖具有较强的抑制作用，对氧浓度的依赖性较小，在缺氧和正氧条件下，肿瘤细胞的生存能力分别下降27.5%和18.6%，死亡率的差异主要是由于不同条件下1O2和·O2-的含量及其对肿瘤细胞的毒性。此外，利用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行的流式细胞术显示，CDT和SDT联合作用在常温(凋亡率为81.3%)和缺氧(凋亡率为69.2%)环境下均表现出良好的治疗效果，这与MTT数据一致，为后续实体瘤治疗奠定了基础。考虑到总ROS水平的可比性和实际应用，后续的细胞免疫应答实验均在常规细胞培养条件下，特别是常氧条件下进行。
SDT&CDT促进细胞免疫反应
为了进一步证明ROS对细胞凋亡的促进作用，我们研究了线粒体膜电位(MMP)的变化，因为MMP的降低是细胞凋亡的早期指标。我们利用JC-1染色来阐明不同条件下产生的ROS对细胞MMP的影响。当JC-1的荧光由红色变为绿色时，表明线粒体膜功能受到破坏。在H2O2 + US组中，JC-1单体的绿色荧光较弱，说明H2O2本身毒性较弱。NPs + US组和NPs + H2O2组细胞的荧光表达强于单独NPs组，进一步解释了ROS的有害作用。定量数据显示，在NPs + H2O2 + US组中，JC-1单体与JC-1聚集体的强度比是对照组的16.5倍，表明MMP大量减少，最终导致线粒体膜破裂，程序性凋亡。当添加维生素C (Vc)作为ROS抑制剂时，对细胞线粒体无明显损伤。另一方面，ROS可能是诱导ICD的关键。基于不同方法处理的细胞内CRT总量存在可忽略不计的差异，我们测量了其在4个T1肿瘤细胞中的暴露量。单独使用NPs时，可以在细胞膜上看到有限的CRT暴露，而NPs + H2O2或NPs + US组在几个方面表现出2.3倍和3.9倍的促进作用，与各组ROS含量呈正相关。NPs + H2O2 + US组荧光最强，荧光强度是NPs组的8.2倍。加入Vc后，荧光被猝灭，证实了ROS直接导致ICD。从细胞上清中检测HMGB1和ATP的释放，以便更好地验证。统计显示，NPs单独处理后，HMGB1的浓度约为2.7 μg/L。2.4倍的水平调节我们辐照后,它增加了NPs +过氧化氢组的2.0倍。两者联合后，HMGB1的释放量最高，为11.9 μg/L。同样，各组ATP排泄量的变化趋势与HMGB1的变化趋势一致，说明MnClPc@HSA-mediated SDT&CDT可以选择性地引起HMGB1的爆发和ATP的外排，从而最终促进抗肿瘤免疫应答。
体内抗肿瘤作用及免疫实验
通过生化标准和器官检测确保该疗法的组织相容性后，利用MnClPc@HSA NPs进行体内抗肿瘤。肿瘤体积缩小、苏木精-伊红(H&E)染色和tdt介导的dUTP尼克末端标记(TUNEL)实验均表明，MnClPc@HSAaugmented CDT&SDT与生理盐水组相比，具有最显著的抗肿瘤作用。CRT版本作为ICD的决定性生物标志物，首先通过免疫荧光染色对小鼠肿瘤组织进行分析。与生理盐水组相比，NPs + US处理诱导CRT表达增加7.1倍，与体外实验结果一致(图5d;S18无花果。美国)。为了评估ICDs诱导的免疫应答，我们随后证明了MnClPc@HSA NPs在体内促进dc成熟和分泌免疫细胞因子的能力。其中，US单独导致脾脏(20.5%)和肿瘤(18.7%)的DC弱成熟，可能是由于超声空泡对某些肿瘤细胞机械损伤后产生的凋亡片段。然而，NPs + US组在脾脏诱导了高水平的dc成熟(54.8%)，显著高于NPs组(39.2%)和US单独组(20.5%)。同时，NPs + US组在肿瘤中的DCs成熟率(43.4%)高于NPs组(27.2%)和US组(18.7%)。平行实验在其他小鼠中也显示出相同的变化趋势。此外，4只T1荷瘤小鼠血清细胞因子(如TNF-α和IFN- γ)的变化表明，NPs和NPs + US都促进了促炎细胞因子的分泌，有利于触发针对肿瘤的免疫反应。
SDT&CDT联合PD-L1阻断抑制肿瘤迁移
癌症死亡的主要原因是肿瘤转移，通常伴随着对常规治疗的抗药性。因此，理想的癌症治疗应该是消除原发肿瘤，并在所有转移部位识别、抑制和去除任何残留的癌细胞。PD- 1/PD- l1检查点阻断已被尝试通过抑制细胞毒性T淋巴细胞的消耗来增强抗肿瘤免疫，并且与其他治疗方案联合使用时，临床效果被夸大了。本研究应用PD-L1阻滞剂进一步提高NPs + US的抗肿瘤免疫治疗效果。
为了评估PD-L1阻燃剂与NPs + US的协同抗肿瘤作用，我们采用双侧4 T1荷瘤模型。值得注意的是，单独抗pd - l1对原发肿瘤和远端肿瘤的抑制作用很小，而在NPs + US组中，近端和远端肿瘤随时间的生长趋势被明显抑制。结合上述CRT的免疫荧光数据，可以进一步说明该治疗引起免疫原性细胞死亡，导致自身免疫效应，具有较好的治疗效果。在PD-L1阻断的帮助下，我们不仅以97.9%的体积缩小率(VRR)根除了原发肿瘤，而且显著抑制了远处肿瘤的生长(VRR: 75.9%)。随后，我们通过H&E染色和TUNEL实验进一步评估了两种肿瘤的细胞凋亡情况。抗pd - l1处理后的肿瘤组织学结果显示肿瘤细胞相对致密，结构完整。而NPs + US或NPs + US + anti-PD-L1处理后，肿瘤细胞分离稀疏，表明大部分肿瘤细胞发生凋亡或坏死。在TUNEL实验中，高百分比的TUNEL阳性细胞(黄色凋亡细胞)也维持了这些结果。
为了了解抗肿瘤作用的潜在机制，我们在第一次治疗后第14天对原发肿瘤和模拟远处肿瘤的免疫细胞进行了评估。在近端肿瘤中，定量分析显示实验组CD4+和CD8+荧光强度最高，分别比对照组高12倍和12.8倍。远端肿瘤表现出同样的趋势，荧光强度分别是对照组的25倍和37倍。免疫荧光强度的增强提示CD4+和CD8+ T细胞浸润到原发和远处肿瘤。CD8+ T细胞的生长速度强于CD4+ T细胞，表明T细胞比效应T细胞更容易分化为细胞毒性T细胞。最后采集各组双侧4 T1荷瘤大鼠肺组织，直接评价肺转移情况。肺结节肉眼观察显示，与其他三组相比，NPs + US + anti-PD-L1对肺转移有明显的预防作用，肺结节数量从8个减少到几乎没有。
总结
我们开发了MnClPc@HSA纳米组件，并通过us增强化学动力学疗法证明了它们的免疫治疗效果。该纳米组件不仅可以作为SDT的声敏剂，还可以促进肿瘤源性H2O2转化为致死⋅O2 -和1O2，解决了缺氧TME对氧依赖性SDT效率的束缚，有效改善H2O2诱导的肿瘤高酸性环境，抑制肿瘤侵袭转移。CDT和SDT协同作用产生多种ROS，放大内质网氧化应激，诱导肿瘤细胞免疫原性死亡，激活免疫细胞并伴随自身免疫反应。联合免疫检查点抑制剂α-PD-L1，诱导远端肿瘤免疫应答。体内数据显示，CD8+/CD4+ T细胞在原位和远端肿瘤部位的比例明显增加，抑制了远端肿瘤的生长，同时降低了肺转移的风险。总的来说，这些新的纳米材料有效地克服了低氧TME对单独SDT的限制，并利用CDT和SDT的组合在常氧和低氧环境下实现ROS富集。虽然其他依赖ROS的治疗，如I型光动力治疗，可以部分克服缺氧的局限性，但它们的穿透深度有限。在我们的系统中，CDT与SDT结合不仅解决了SDT的氧依赖问题，还提供了出色的穿透能力，在治疗深部缺氧肿瘤方面具有显著优势。
参考文献
Manganese (III) phthalocyanine complex nanoassembly: Oxygen-Independent generation of superoxide radicals and singlet oxygen for ultrasound-augmented chemodynamic therapy Yun Sun, Chao Li, Zhaoyang Liu, Chaojie Tang, Zhankun Cui, Zhiguo Zhou, Qian Liu *, Wu Wang *, Shiping Yang, Hong Yang *, Chemical Engineering Journal 495 (2024) 153363. https://doi.org/10.1016/j.cej2024.153363
