内容提要
光学成像是研究生物或病理过程和诊断疾病的关键。较差的组织穿透通常限制了传统的光学成像。我们报告了一种成像技术，利用超声波通过两步粒子内能量转换来激活发光分子或纳米粒子。超声波激活可以通过压电效应将机械波动转化为化学能，然后通过化学发光效应诱导发光。我们展示了超声诱导发光成像的两种模式:一种是在超声激发停止后实现延迟成像，另一种是在超声激发期间实现实时成像。与水的声致发光相比，我们的成像方式将发光强度提高了2000倍，与荧光成像相比，信噪比提高了10倍，空间分辨率为1.46毫米，组织穿透深度高达2.2厘米。我们证明其适用于成像皮下和原位肿瘤，绘制淋巴结和筛选腹膜转移肿瘤。此我们设计了基于共振能量转移的可分析物激活发光探针，可以评估药物诱导的肝毒性并区分药物治疗后肿瘤的反应性。我们期望我们的技术能够进一步实现临床前和临床应用，例如活体动物组织病理学病变的研究，肿瘤的早期检测，生物分子的分析和癌症治疗或预后的监测等。
实验结果与结论
超声诱导发光成像的分子筛选和纳米颗粒设计
我们通过使用表面活性剂转化15种不同类型的发光分子合成了水溶性纳米颗粒，这些发光分子包括卟啉、BODIPY、菁氨酸、三蒽衍生物、A -D-A ' -D-A共轭分子(其中D是电子供体，A是电子受体)和半导体聚合物。对这些纳米颗粒的吸收和荧光光谱进行了表征。透射电子显微镜(TEM)图像和动态光散射分析证实，TD纳米颗粒呈球形，尺寸分布狭窄，约为30-40 nm。
为了收集超声诱导发光光子，我们建立了新的成像装置，并在补充方法中进行了描述。采用两种超声诱导发光成像模式:超声停止激发后延迟发光成像;超声激发时的实时发光成像。在延迟成像模式下，超声换能器放置在溶液样品下/中或动物组织表面，利用超声偶联凝胶激发纳米颗粒。
超声激励停止后，立即将样品或动物转移到成像暗箱中，使用无光激励的冷却CCD(电荷耦合器件)相机(来自IVIS Lumina XR成像系统)获取图像。在实时成像模式下，将超声换能器置于成像暗箱内，在暗箱内对样品进行超声波激发。无需转移样品即可同时获得超声诱导发光图像。首先，我们利用超声激发研究了纳米颗粒的延迟超声诱导发光。图像显示，除了姜黄素和IR780纳米颗粒外，各种纳米颗粒都有超声诱导的发光光子发射。基于卟啉的纳米粒子(Ce6和F-PpIX)比基于BODIPY和花青素的纳米粒子(ICG和HD)表现出更高的发光强度。在半导体聚合物基纳米粒子中，PFODBT基纳米粒子的发光强度最高。在所有测试的纳米颗粒中，TD NPs表现出最强的发光强度。与H2O、PFODBT-和CE6纳米粒子相比，TD纳米粒子的发光强度分别提高了2389.6倍、71.6倍和71.3倍。
随后，我们采集了纳米颗粒在超声激发下的实时超声诱导发光。与其他纳米粒子相比，TD纳米粒子、卟啉纳米粒子和PFODBT纳米粒子表现出更强的发光强度。同样，在测试的纳米颗粒中，TD NPs显示出最高的发光强度，与H2O相比增加了1,428.1倍。此外，在荧光模式下，在适当的激发下获得荧光图像和强度。
超声诱导发光成像的研究
我们重点研究了TD NPs的发光性能，采用延迟超声诱导发光成像模式，即超声激发停止后成像。优化表面活性剂后，我们发现DSPEPEG(1,2-二脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[甲氧基(聚乙二醇))包覆的TD NPs具有最高的发光强度)。随后，我们用不同频率(30、40、50和100 kHz)的超声预激发TD NPs，观察到相似的发光光谱，峰值在625-650 nm，与荧光光谱一致。随着超声激发时间的增加，TD NPs的发光强度也在不断增加，在90 s时达到最大值。同样，超声激发功率密度的增加导致TD NPs的发光强度增加。TD纳米粒子的超声诱导发光强度与纳米粒子浓度呈线性正相关。在超声激励停止后，我们观察到来自TD NPs的持久信号超过7小时，半衰期约为180秒。为了评估从TD NPs发出的超声诱导发光的组织穿透深度，我们使用不同的组织厚度，并在两种模式下进行测试。尽管超声诱导发光和荧光信号都随着组织厚度的增加而下降，但与荧光成像相比，超声诱导发光成像表现出更高的信噪比和更大的组织穿透(可达2.2 cm)。同时，我们观察到超声功率传递效率(η)随着组织厚度的增加而降低。此外，超声诱导发光的空间分辨率采用半最大全宽度测量进行评估，结果显示，0 mm组织的空间分辨率为1.46 mm。
我们研究了超声激发时TD NPs的实时超声诱导发光性能，当超声激发功率密度增加时，发光强度增强。随着纳米颗粒浓度的增加，TD NPs的实时超声诱导发光强度也随之增加。在0 ~ 30min的连续超声激发过程中，TD NPs的发光强度逐渐增大，在6min达到最大值，然后逐渐减小。最后，我们探索了1 MHz和3 MHz高频超声刺激发光的潜力，我们观察到随着超声激发功率密度的增加、激发时间的延长和纳米颗粒浓度的增加，TD NPs的延迟超声诱导发光强度持续增加。因此，成像方式、激发持续时间、激发功率密度、超声频率、纳米颗粒表面活性剂及其浓度、信号采集时间点等因素对TD NPs的超声致发光性能均有影响。然而，超声诱导的发光光谱与激发频率无关。
超声致发光机理
为了研究超声致发光的机制，我们进行了一系列的实验。这些实验旨在确认TD NPs的压电效应，探索超声波激发时ROS的产生，检测TD NPs与ROS之间的化学反应，并评价产生的化学发光。当施加超声波时，特别是来自TD分子的开路电压增加，证实了TD NPs的压电效应。此外，与O2饱和条件相比，在N2饱和条件下，TD NPs或TD分子的超声诱导发光信号被抑制，这表明在发光中的重要作用。1,3-二苯基异苯并呋喃在416 nm处的吸收峰降低，证实了TD NPs产生ROS。电子自旋共振(ESR)谱进一步证实了超声激发下TD NPs产生单线态氧(1O2)和羟基自由基(HO•)。将1O2和HO•与TD NPs直接孵化能产生强烈的化学发光，而加入ROS自由基清除剂可有效抑制TD NPs的超声诱导发光强度，这表明ROS与纳米颗粒中的TD分子发生反应诱导化学发光，而过量的ROS则扩散并与自由基清除剂相互作用。将TD NPs直接加热到40°C时，并没有产生明显的发光，这表明所观察到的发光不能归因于超声波激发时的热效应。
在超声振动作用下，TD NPs通过压电效应产生极化电荷，通过压电催化产生1O2和HO•.。这些ROS随后与TD分子发生反应，形成中间体，通过MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)分析证实了这一点。最初的TD分子被 1O2或HO•氧化导致HO•种和氧原子的加入，形成TD-•OH中间体(I)或二氧乙烷中间体(II, III)(分子量分别为1,086,1,103和1,199)。这些二氧乙烷中间体(II, III)逐渐被解理，而TD-•OH中间体(I)与O2反应，导致C-C键断裂，化学能逐渐释放18,38,39。最后，中间体的化学能被转移到附近完整或被破坏的TD分子上，产生发光。在确定了超声诱导发光的机制后，我们设计了复合纳米颗粒来增强PFODBT纳米颗粒(PFODBT NPs)中较弱的超声诱导发光强度。将各种化学发光底物，如HBA-COOH、SO、CPPO和HBA-Cl掺杂到PFODBT NPs中。具体来说，与未掺杂的PFODBT NPs相比，在PFODBT NPs (PFODBT@HBA NPs)中掺入HBA-COOH后，其发光强度提高了121.4倍。在复合纳米颗粒中，PFODBT的压电效应将超声波能量转化为ROS, ROS与HBA-COOH反应产生更高的化学发光强度。同样，掺和HBA-COOH也可以提高BTz-IC-H-、BODIPY-Br-和pfbt纳米颗粒的超声诱导发光强度(分别为19.3倍、5.5倍和2.3倍)。
超声诱导的体内发光成像
得益于纳米颗粒的细胞相容性，除非另有说明，我们使用延迟超声诱导发光成像模式在体内研究了纳米颗粒在超声下诱导发光的能力。为此，在超声刺激后将TD NPs溶液置于小鼠腹部。从小鼠的上侧观察到超声诱导的强烈发光信号，而荧光信号与背景几乎无法区分，表明超声诱导的发光在体内具有良好的穿透性。在荷瘤小鼠体内注射TD NPs后，肿瘤区域被超声激发并表现出强烈的发光，而小鼠其他部位几乎没有检测到背景信号。计算超声诱导发光的信噪比为~206，是荧光的11.7倍。随后，我们静脉注射TD NPs，注射后6 h超声刺激肿瘤区域，肿瘤区域有较强的发光信号，表明TD NPs具有有效的肿瘤靶向能力。此外，在实时超声诱导发光成像模式下，超声激发时肿瘤区域也表现出较强的发光信号。
我们构建了小鼠多形性胶质母细胞瘤(GBM)肿瘤模型，并通过脑切片的血红素和伊红(H&E)染色证实了这一点。经静脉注射TD NPs后，原位承载gbm的小鼠在超声激发后头部区域出现动态增强信号，表明该成像系统可用于深部肿瘤。此外，我们使用TD NPs对胰腺荷瘤小鼠进行超声诱导发光成像。随着时间的推移，原位胰腺荷瘤小鼠胰腺区域信号动态增加。我们使用超声诱导发光成像诊断转移性肿瘤。在荷瘤小鼠的肠道中检测到强烈的发光斑点，表明转移瘤的存在，而在健康小鼠中未观察到明显的信号。通过H&E染色进一步证实转移瘤的存在。相比之下，荧光图像中的自身荧光非常强烈，很难检测到转移性肿瘤。我们还通过直接向小鼠后爪注射TD NPs对淋巴结进行成像。腹股沟淋巴结超声诱导发光信号强，信噪比高于荧光信号。同时，这种超声诱导的发光可以再激发三次，最大强度没有明显的衰减，证明了多次和纵向体内成像的能力。
可激活超声诱导发光探针
酶在各种生物过程中起着至关重要的作用，强调了其动态活动成像的重要性。在这项研究中，我们提出了基于共振能量转移，将不同的酶可切割肽序列作为供体-受体对之间的连接体，设计酶激活超声诱导发光探针。首先，我们引入了一个颗粒酶b可切割肽序列(il - glu - ph - asp (IEFD))作为TD NPs(供体)和BHQ-3(受体)之间的连接物，创建了一个颗粒酶b可激活的超声诱导发光探针(TD- grz - bhq)。通过吸收光谱和荧光光谱对TD-Grz-BHQ进行了表征。得到的TD-Grz-BHQ探针在590nm和690nm处有两个吸收峰。此外，TD-Grz-BHQ的微弱荧光发射证实了BHQ-3在空间约束下的有效猝灭。
我们评估了TD- grz - bhq作为颗粒酶B体外检测传感器的性能。与颗粒酶B孵育后，测量了TD- grz - bhq的超声诱导发光信号。结果表明，在颗粒酶B存在的情况下，TD NPs与BHQ-3之间的IEFD肽被切割，产生强烈的超声诱导发光信号。这证明了TD-Grz-BHQ探针具有理想的“信号接通”行为的传感器能力。信号量化显示，发光强度与颗粒酶B浓度呈线性相关。重要的是，TD-Grz-BHQ在其他酶或生物分子存在时没有表现出任何明显的信号激活，证实了该探针对颗粒酶B的特异性。基于这种共振能量传递，TD-Grz-BHQ可以作为定制各种酶响应超声诱导发光探针的通用平台。例如，使用不同的酶可切割肽序列作为连接体，如Gly-Pro-Leu - Gly-Ile-Ala (GPLGIA;基质金属蛋白酶-2 (MMP-2)-可切割肽序列)或Asp-Glu-Val-Asp (DEVD;(caspase-3可切割肽序列)，我们可以分别创建检测MMP-2和caspase-3的探针，如TD-MMP-BHQ和TD-caspase-BHQ。此外，我们将IR780(一种对过氧亚硝酸盐(ONOO -)有反应的花青素染料)加入到TD NPs中，构建探针TD@IR780 NPs，通过共振能量转移对ONOO -进行成像。
颗粒酶B超声诱导发光成像监测活体小鼠免疫应答
癌症免疫治疗是改善患者预后的重要途径，它可以增强宿主免疫力，诱导长期免疫记忆效应，从而抑制肿瘤复发和转移。然而，不同肿瘤和治疗类型的免疫治疗效果差异很大。早期区分对治疗有反应的患者和无反应的患者将有助于对无反应的患者进行分类，使其远离无效的治疗。然而，在肿瘤体积分化之前，仍然很难区分高应答者和低应答者。颗粒酶B是一种丝氨酸蛋白酶，由CD8+ T细胞和自然杀伤(NK)细胞在免疫应答过程中释放，在通过细胞毒性淋巴细胞介导癌细胞死亡中起关键作用。因此，开发实时准确的颗粒酶B成像技术以区分不同肿瘤类型的免疫应答具有重要意义。在本研究中，我们利用TD-Grz-BHQ对颗粒酶B进行成像，并区分两种肿瘤模型中抗程序性细胞死亡配体1 (anti-PDL1)治疗后的免疫反应。在抗pdl1治疗后的CT-26肿瘤中检测到TD-Grz-BHQ的超声诱导发光信号。该信号高于在4T1肿瘤中观察到的信号。相比之下，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的肿瘤在CT-26或4T1肿瘤中均未表现出强烈的发光信号激活。通过免疫荧光染色和颗粒酶B、细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的流式细胞术分析证实，抗pdl1治疗后，CT-26肿瘤的颗粒酶B、CD8+ T细胞和NK细胞水平高于4T1肿瘤。使用TD-Grz-BHQ探针在肿瘤区域激活超声诱导的发光信号归因于活化的CD8+ T细胞和NK细胞释放的颗粒酶B增加。这些结果表明，TD-Grz-BHQ不仅可以监测CT-26肿瘤的免疫治疗反应，还可以区分CT-26和4T1肿瘤的免疫反应。
我们进一步研究了TD-Grz-BHQ超声诱导发光成像在体外响应可视化方面的潜力。肿瘤的体外效应是指免疫治疗不仅能消除原发肿瘤，而且还能抑制远处肿瘤的生长。然而，体外反应可能会受到肿瘤区域广泛耐受的阻碍，因此很难预测免疫治疗的反应。为了解决这一挑战，我们使用TD-Grz-BHQ超声诱导的颗粒酶B水平发光成像来评估接受奥沙利铂联合抗pdl1治疗的小鼠的体外反应。在CT-26荷瘤小鼠中，用奥沙利铂或PBS治疗原发肿瘤，然后注射抗pdl1和超声诱导发光成像。我们首先对原发肿瘤进行成像，观察到奥沙利铂治疗的原发肿瘤比pbs治疗的原发肿瘤发光信号更高。随后，与用PBS治疗原发肿瘤的小鼠相比，用奥沙利铂治疗原发肿瘤的小鼠的远端肿瘤显示出增强的发光信号。这一发现表明，在奥沙利铂联合免疫检查点阻断治疗期间，TD-Grz-BHQ可用于监测原发性和远处肿瘤的颗粒酶B水平。采用免疫荧光染色或流式细胞术分析检测颗粒酶B的表达水平以及肿瘤中细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的数量。这些结果表明，与单一治疗(静脉注射抗pdl1)相比，联合治疗(奥沙利铂治疗原发性肿瘤联合静脉注射抗pdl1)导致原发性和远处肿瘤中CD8+ T细胞和NK细胞的浸润增加，颗粒酶B水平更高。此外，TD@IR780 NPs探针在药物性肝毒性模型中显示出检测ONOO -的能力。
结论
本研究介绍了通过两步粒子内能量转换过程实现强烈和活体超声诱导发光成像的进展。值得注意的是，超声诱导发光的强度超过声致发光，同时表现出最小的背景噪声，与传统荧光成像相比，信噪比、成像灵敏度和成像深度都有所提高。此外，与x射线激活发光、生物发光或切伦科夫发光相比，它具有几个关键优势，包括无辐射操作、手持式激发、易用性、安全性和不需要昂贵的仪器。
参考文献
In vivo ultrasound-induced luminescence molecular imaging，Youjuan Wang1 , Zhigao Yi , Jing Guo , Shiyi Liao , Zhe Li , Shuai Xu , Baoli Yin , Yongchao Liu, Yurong Feng , Qiming Rong , Xiaogang Liu , Guosheng Song , Xiao-Bing Zhang & Weihong Tan ， Nna. photonics， 2024, 3208. https://doi.org/10.1038/s41566-024-01387-1
