内容提要
声动力疗法(SDT)由于其非侵入性和不依赖抗生素和光源，在解决多药耐药细菌感染方面显示出巨大的潜力。目前大多数声敏剂表现出聚集引起的猝灭(ACQ)，导致活性氧(ROS)的产生效率低。本文介绍了一种新的非平面结构声动力(4,4-二氟-4-硼-3a,4-二氮-吲哚二烯)BODIPY衍生物BODN，它具有聚集诱导发射(AIE)特性，并能通过超声快速产生大量活性氧。BODN与商用两亲性聚合物mDSPE-PEG2000共同组装，形成BODN纳米颗粒(BODN- np)。在超声条件下，BODN- np显示出强大的抗菌活性，并改善炎症反应，促进金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的伤口愈合。这项工作扩大了AIE声动力材料在抗菌治疗中的应用，为抗多药耐药细菌感染的创新解决方案提供了新的视角。
实验结果与讨论
BODN的合成和量化研究
采用三步反应合成了BODN。2,4-二甲基- 1h -吡咯(定义为Y1)与三氟乙酸通过Knoevenagel缩合反应生成BODIPY(定义为Y2)，然后与4-溴苯甲醛通过Knoevenagel缩合反应得到含有BODIPY(定义为Y3)的小分子。通过Buchwald-Hartwig将Y3与4-苯基二苯胺偶联合成BODN。将BODN溶解于四氢呋喃中，用紫外-可见吸收光谱研究了其光学性质。BODN在650-900 nm范围内具有较强的吸收，最大吸收峰为812 nm。然后利用密度泛函理论(DFT)对边界分子轨道上的电子云进行了分析，DFT计算的优化几何形状表明，BODN中三苯胺与Y3苯环之间的二面角为34.02°。这种扭曲的分子结构可以有效地减少分子间的相互作用，如聚集/固体状态下的堆积(非辐射衰变)，提高系统间交叉(ISC)，使吸收的能量有效地用于ROS和荧光的产生。BODN的HOMO(最高占据分子轨道)的电子云主要分布在三苯胺附近，而LUMO(最低未占据分子轨道)的电子云主要分布在BODIPY的底部。用荧光光谱法研究了BODN的AIE性质。BODN在良好溶剂二甲基亚砜(DMSO)中表现出微弱的荧光，在加入劣质溶剂甲苯后，随着甲苯浓度的增加，其荧光强度逐渐增强，荧光强度增加3.7倍，验证了BODN的AIE光致发光特性。
BODN纳米粒子溶液中活性氧的评价
为了解决这一问题，通过纳米沉淀法将BODN与mPEGDSPE2000共组装，形成了物理化学性质更好的BODN- np。透射电镜(TEM)图像显示，BODN-NP呈均匀完整的球形。动态光散射(DLS)结果显示，BODN-NP的平均粒径为184 nm，多分散性指数(PDI)值为0.2，表明BODN-NP在水溶液中的分散性良好。在室温下保存14 d期间，bdn - np的尺寸没有明显变化，表明纳米颗粒具有良好的稳定性。BODN-NP的zeta电位约为-20 mV。BODN- np的最大吸收波长为810 nm，与BODN的吸收带相同，说明纳米粒子的组装不会影响BODN的光物理性质。 为了评估BODN-NP在US条件下生成ROS的能力，采用3,4-二氢-2,3-二甲基- 2h -吡罗1-氧化物(DMPO)和4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶(TEMP)为基础的电子自旋共振(ESR)分别检测HO•和1O2。加入BODN-NP后，在US条件下观察到HO•和1O2的特征峰，而在没有US的情况下，没有观察到HO•和1O2的特征峰。这些结果证明了BODN-NP在US条件下可以有效地产生ROS，并具有优异的声动力性能。利用瞬态稳态荧光光谱仪对BODN-NP的荧光特性进行了研究，结果表明，BODN-NP在900 - 1400 nm具有较强的荧光，可用于近红外第二区(NIR-II)的生物成像。我们以商用光敏剂吲哚菁蓝(ICG)作为参比化合物，观察到ICG的荧光随浓度的增加而降低，而bdn - np的荧光随浓度的增加而逐渐增强，说明ICG在高浓度时发生ACQ作用，而bdn - np具有AIE作用。此外，在900 ~ 1400 nm的发射范围内，bdn - np的QY高达37.2%，几乎是ICG的两倍(QY = 14.3%)。
BODN纳米粒子抗菌研究
为了评估BODN-NP的体外抗菌活性，首先测试了BODNNP在不同菌株中的最低抑菌浓度(MIC)，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、MREC和MRSA。(体外抗菌US功率为1.5 W cm-2，持续，3 MHZ, 1 min)。BODN-NP (400 μg mL-1)在1.5 W cm-2的US功率下处理，大肠杆菌在1分钟内的存活率仅为0.3%。在常规平板包被法下，400 μg mL-1的BODN-NP处理后，在固体培养基上几乎看不到大肠杆菌菌落形成单位(cfu)。用扫描电镜观察了BODN-NP处理后细菌的形态变化。PBS处理的大肠杆菌与BODN-NP处理的大肠杆菌之间无显著差异。用US处理的大肠杆菌呈轻微的皱褶和凹形，而用BODN-NP和US (BODNNP+US)处理的大肠杆菌形态严重皱褶和凹形，部分膜完全破坏。此外，用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进行活/死染色和分析。与PBS和BODN-NP处理的大肠杆菌相比，BODN-NP+US处理的大肠杆菌显示死菌(红色荧光)明显多于活菌(绿色荧光)。对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌也进行了类似的抗菌实验。bdn - np (400 μ mL-1)和US作用后金黄色葡萄球菌的存活率仅为1.5%。经BODN-NP +US处理后，金黄色葡萄球菌的膜严重破裂。活/死染色进一步证实，BODN-NP + US处理可诱导金黄色葡萄球菌显著死亡。在US条件下，BODN-NP能有效杀灭革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌，具有良好的抗菌效果。
BODN纳米粒子的抗菌机制研究
为了进一步了解BODN-NP抗菌活性的作用机制，我们对PBS、BODN-NP或BODNNP+US处理的MRSA进行了代谢组学分析。与PBS相比，BODN-NP处理上调了30种代谢物，下调了18种代谢物，而BODNNP+US处理上调了19种代谢物，下调了28种代谢物。与BODN-NP处理相比，BODN-NP+US处理上调26种代谢物，下调42种代谢物。氨基酸、天冬氨酸的后续途径，丙氨酸、谷氨酸的代谢途径，甘氨酸、苏氨酸、丝氨酸的代谢途径，以及氰尿酸的代谢途径。此外，BODN-NP+US处理进一步增强了硫胺素代谢、泛酸和COA的生物合成。氨基酸作为生物体中所有细菌生存所必需的营养物质，与细菌的代谢过程和细菌的发育有着千丝万缕的联系。我们还通过热图显示了不同处理之间代谢物的差异。不同处理的不同作用模式。综上所述，代谢组学分析进一步验证了BODN-NP+US可引起细菌损伤，并表现出出色的抗菌活性。
BODN纳米粒子体内抗菌活性研究
我们首先进行了溶血试验。当BODN-NP浓度达到400 μg mL-1时，血细胞溶血率仍低于5%，表明BODN-NP具有最佳的生物相容性。此外，用人正常肝细胞(LO2)来评估bdn - np的潜在毒性，在高浓度bdn - np (400 μg mL-1)培养24小时后，超过91%的LO2细胞存活。 在感染金黄色葡萄球菌或MRSA的BALB/c小鼠皮下创伤模型中，研究了BODNNP+US的抗菌和伤口愈合能力。首先用NIR-II成像系统分析静脉注射后BODN-NP的生物分布。BODN-NP在伤口部位的荧光强度在注射后增加，并在12 h达到峰值。96 h后处死动物模型，采集主要脏器，荧光成像测定生物分布。虽然在肝脏中发现了大部分BODN-NP(这是纳米颗粒制剂的典型情况)，但在伤口中也检测到大量BODN-NP。为评价治疗效果，动物分别静脉注射PBS或BODN-NP。注射24小时后，伤口部位暴露于US处理(1.5 W cm-2，持续，3 MHZ, 2 min)。金黄色葡萄球菌感染后第9天，bdn - np +US处理的伤口面积从79.3 mm2显著减少到5.8 mm2。相比之下，PBS处理小鼠的感染面积仅减少到51.4 mm2。各组小鼠的体重在第3天略有下降后均有所增加，表明健康状况逐渐改善。与PBS处理9.2 mm2的小鼠相比，bdn - np +US处理的小鼠由MRSA感染引起的伤口面积减少了18.5至1.6 mm2。苏木精-伊红(H&E)染色也验证了BODNNP+US的治疗效果。PBS、PBS+US或bdn - np组炎症细胞浸润增加，表皮增厚。相比之下，用bdn - np +US处理的小鼠皮肤组织显示出新的毛囊，炎症细胞数量减少。
总结
我们设计并引入了一种具有AIE特征和声动力活性的突破性bodipy样小分子BODN。BODN在900-1000 nm范围内的强荧光使其成为NIRII生物成像的有希望的候选者。BODN与mDSPE-PEG2000共组装形成BODN- np，在US条件下产生HO•和1O2。体外处理BODN-NP和US对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，包括其耐多药菌株，均有近100%的抑制作用。在感染金黄色葡萄球菌和MRSA的小鼠中，全身给药BODN-NP可增强伤口部位的积累，与US联合治疗可促进伤口愈合过程，具有出色的生物相容性和生物安全性。这种具有NIR-II荧光的AIE声敏材料为耐多药细菌感染的治疗提供了新的前景。
参考文献
A Bodipy-Based Aggregation-Induced Emission Nanoagent for Sonodynamic Antibacterial Studies， Yan Xu, Dongsheng Tang, Leijiao Li,* Xuan Li, Qi Chang,* Haihua Xiao, and Wenliang Li*，Adv. Funct. Mater., 2024, 2315385， https://doi.org/10.1002/adfm.202315385
