内容提要
本研究构建了一种新型多功能治疗平台，该平台整合了超声触发的声动力治疗（SDT）、STING 通路激活及 CXCR4 抑制功能，可用于胶质母细胞瘤的协同免疫治疗。研究人员发现了一种含硒化合物，该化合物具有优异的声动力性能。这种高性能声敏剂与 STING 激动剂前药共组装，随后进一步包裹胶质瘤细胞膜并修饰 CXCR4 靶向肽，以实现双重靶向归巢与免疫调节功能。在超声照射下，该纳米平台可诱导产生大量活性氧（ROS），同时促进 STING 激动剂的自加速释放；这一过程不仅能显著激活先天性和适应性免疫反应，还能破坏 CXCL12/CXCR4 信号轴，从而抑制免疫抑制细胞的浸润。
实验结果与讨论
有机声敏剂的合成与声动力性能
我们设计并合成了三种具有不同取代原子的供体-受体-受体（D-A1-A2）型分子。三苯胺（TPA）和二苯甲酮（BP）分别被选为供体（D）和受体（A2）单元，苯并噻二唑（BZ）衍生物作为另一个受体（A1）单元，其中X分别为 O、S 和 Se（对应苯并恶唑、苯并噻唑和苯并硒唑）。TB-O、TB-S 和 TB-Se 在四氢呋喃（THF）中的吸收光谱和光致发光（PL）光谱具有相似性，最大吸收波长分别为 465、447 和 462 nm，最大发射波长范围为 650-690 nm。以 DSPE-PEG₂₀₀₀为表面活性剂，通过纳米沉淀法将这些疏水分子制备成纳米颗粒（NPs）。O NPs、S NPs 和 Se NPs 的最大吸收波长范围为 450-480 nm，最大发射波长范围为 640-710 nm，与溶液中的光谱相似。1,3 - 二苯基异苯并呋喃（DPBF）被用作单线态氧（1O2）的指示剂，因为其在可见光区域的吸光度会随氧化作用而降低。对纳米颗粒溶液进行超声（US）照射（1 MHz、1.0 W・cm-2、40% 占空比）后，5 分钟内 DPBF 在 420 nm 处的吸光度显著下降。其中，O NPs、S NPs 和 Se NPs 处理组的 DPBF 吸光度分别降低了 19%、26% 和 40%，这表明 Se NPs 的声动力治疗（SDT）性能最优。此外，我们观察到活性氧（ROS）的产生具有浓度和功率依赖性 ——Se NPs 浓度越高、超声强度越强，声动力治疗效果的协同增强作用越显著。相比之下，临床常用的亚甲蓝（MB）在相同条件下仅能使 DPBF 分解 13%，分解效率十分有限。我们采用电子顺磁共振（EPR）光谱法鉴定生成的 ROS 类型。以 2,2,6,6 - 四甲基 - 4 - 哌啶酮（TEMP）为自旋捕获剂，在超声照射下可观察到对应 ¹O₂的特征峰，而未进行超声照射时则检测不到该信号。同时，以 5,5 - 二甲基 - 1 - 吡咯啉 - N - 氧化物（DMPO）为羟基自由基（・OH）捕获剂进行 EPR 分析，也观察到了・OH 的特征峰。这些结果明确证实，Se NPs 在超声照射下可同时生成 ¹O₂和・OH。经过 4 次连续超声循环（每次 5 分钟）后，Se NPs 经超声诱导产生的 ¹O₂信号几乎无变化，表明其具有优异的声稳定性。相比之下，临床常用的 MB 在相同处理后，吸光度仅能维持初始强度的约 88%。
di-MSA-2 前药的合成及响应性
我们通过二硒键将两个 STING 激动剂（MSA-2）偶联，合成了一种新型前药（di-MSA-2），该前药可在活性氧（ROS）高表达的肿瘤微环境（TME）中选择性释放 MSA-2。声动力治疗（SDT）过程中产生的 ROS 还能进一步促进前药激活，从而降低脱靶副作用。在 ROS 存在的条件下，二硒键可被氧化为亲水性的硒氧化物或硒酮，进而促进相邻酯键水解，最终实现 MSA-2 的激活。为探究 di-MSA-2 释放 MSA-2 的规律，我们采用高效液相色谱（HPLC）监测不同浓度 H₂O₂处理下体系的变化。结果显示，di-MSA-2 的保留时间为 24.64 分钟，而 MSA-2 的保留时间为 3.05 分钟。随着 H₂O₂浓度升高，di-MSA-2 对应的色谱峰逐渐降低，而 MSA-2 对应的色谱峰则逐渐升高。HPLC 结果证实，di-MSA-2 在 H₂O₂处理下可高效裂解，实现 MSA-2 的可控释放。
纳米颗粒（NPs）的制备与表征
获得高性能声敏剂 TB-Se 和 ROS 响应性前药 di-MSA-2 后，我们通过纳米沉淀法将二者共组装为 SeM NPs，实现 SDT 与 STING 激动剂按需激活的整合。为进行对比，我们还分别以 TB-Se 和 di-MSA-2 为原料，制备了单组分纳米制剂 Se NPs 和 M NPs。为提升肿瘤靶向能力，我们在 SeM NPs 表面包裹 GL261 胶质瘤细胞膜，并进一步插入聚乙二醇修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG）偶联 CXCR4 靶向肽（LGASWHRPDK）。仿生 GL261 细胞膜包裹可通过降低紧密连接中的特定蛋白，提升纳米颗粒的血脑屏障（BBB）穿透能力；此外，CXCR4 靶向肽修饰不仅能进一步引导纳米颗粒向肿瘤部位富集，还可干扰 CXCR4 介导的肿瘤细胞迁移及免疫抑制信号传导。我们通过 HPLC 验证 CXCR4 靶向肽的修饰效果，结果显示 SeM@GL NPs 的 HPLC 谱图中出现了 DSPE-PEG-LGASWHRPDK 对应的特征保留峰，证实 CXCR4 靶向肽已成功修饰于 SeM@GL NPs 表面。采用动态光散射（DLS）和透射电子显微镜（TEM）对 SeM NPs 和 SeM@GL NPs 的粒径与形貌进行表征。结果显示，与 SeM NPs 相比，SeM@GL NPs 的粒径增加了约 20 nm，这可能是由于表面包裹了 GL261 胶质瘤细胞膜所致。TEM 图像同样显示，SeM@GL NPs 呈球形，且具有明显的外周层结构。所有纳米颗粒的平均粒径均在 80-120 nm 之间，且 zeta 电位均为负值。此外，蛋白质印迹（Western blot，WB）分析证实，SeM@GL NPs 表面存在 CD47 和整合素 αV 等膜特异性蛋白，这些蛋白可帮助纳米颗粒逃避吞噬作用，并在体内实现同源靶向。稳定性研究表明，SeM@GL NPs 和 SeM NPs 在磷酸盐缓冲液（PBS）中储存 7 天后，粒径无显著变化，说明其具有良好的胶体稳定性。
体外细胞靶向性与血脑屏障穿透能力
为评估 SeM@GL NPs 在肿瘤中的内化与穿透能力，研究构建了 GL261 细胞来源的多细胞 3D 球模型。将肿瘤球与 SeM NPs 或 SeM@GL NPs 共孵育 12 小时后，通过激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察纳米颗粒分布。与 SeM NPs 相比，SeM@GL NPs 能更深入地穿透肿瘤球，且分布更均匀。对 20-80 μm 深度范围的定量分析显示，SeM@GL NPs 处理组的荧光强度更高，表明其肿瘤穿透能力显著增强。胶质瘤细胞膜伪装与 CXCR4 靶向肽修饰的结合，协同提升了纳米颗粒对胶质瘤的靶向效率。血脑屏障（BBB）是脑相关药物递送的关键挑战。为评估 SeM@GL NPs 的血脑屏障穿透能力，研究利用 Transwell 小室构建体外血脑屏障模型：上室接种小鼠脑微血管内皮细胞（bEnd.3）以模拟血脑屏障，下室培养 GL261 胶质瘤细胞以模拟胶质母细胞瘤微环境。体外血脑屏障模型建立后，向上室加入不同纳米制剂，6 小时后通过 CLSM 监测下室的荧光信号以评估血脑屏障穿透情况。孵育 6 小时后，SeM@GL NPs 的细胞摄取量是未修饰 SeM NPs 的 1.95 倍。通过流式细胞术进一步定量纳米颗粒在胶质瘤细胞中的内化情况：共孵育 6 小时后收集下室细胞，SeM NPs 处理组下室细胞仅显示微弱荧光信号，表明其血脑屏障穿透能力有限；而 SeM@GL NPs 的细胞内荧光显著增强，是 SeM NPs 的 3.77 倍。这些结果证实 SeM@GL NPs 具有优异的血脑屏障穿透能力和脑肿瘤靶向能力。
体外声动力治疗诱导的肿瘤细胞杀伤效应
通过 CCK-8 实验评估声动力治疗（SDT）介导的肿瘤杀伤效果。首先根据文献报道和预实验优化超声（US）参数：选择 1.0 W・cm-2的功率密度，该参数在声动力治疗中应用广泛。将与 SeM@GL NPs 共孵育的细胞分别暴露于 1 MHz 或 3 MHz 的超声下，尽管 3 MHz 超声对肿瘤的抑制作用略强，但差异无统计学意义；考虑到 1 MHz 超声的组织穿透性更优，故选择该频率进行后续治疗。随后评估照射时间，发现照射 2 分钟即可实现强效肿瘤细胞杀伤，延长至 5 分钟并未显著增强肿瘤细胞抑制效果。因此，后续体外实验采用 1.0 W・cm-2的强度、1 MHz 的频率和 2 分钟的照射时间。随后比较不同处理组的肿瘤细胞存活率，实验分组如下：G1（PBS）、G2（M NPs）、G3（Se NPs + 超声）、G4（SeM NPs + 超声）、G5（Se@GL NPs + 超声）、G6（SeM@GL NPs）、G7（SeM@GL NPs + 超声）。值得注意的是，SeM@GL NPs + 超声组的细胞毒性最强，这表明 SeM@GL NPs 在超声激活下可有效清除肿瘤细胞，其原因在于其强大的活性氧（ROS）生成能力和增强的肿瘤靶向效率。此外，采用钙黄绿素 - AM（calcein-AM）和碘化丙啶（PI）进行活 / 死细胞染色实验，以直接观察细胞存活情况，结果与 CCK-8 实验一致：在所有组中，SeM@GL NPs + 超声处理导致的细胞死亡最显著，证实 SeM@GL NPs 在超声照射下具有强大的细胞毒性；而未进行超声照射的组仅出现轻微细胞死亡，表明纳米制剂本身的细胞毒性可忽略不计。首先以 2',7'- 二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）为荧光探针，评估不同纳米制剂在超声刺激下的 ROS 生成能力。Se NPs、SeM NPs、Se@GL NPs 和 SeM@GL NPs 在超声照射下均能生成大量 ROS，表现为 GL261 细胞中氧化产物 DCF 的绿色荧光显著增强；其中，SeM@GL NPs 在超声照射下的 ROS 生成能力最强，证实 TB-Se 具有优异的声动力性能，且纳米颗粒的靶向能力进一步提升了这一效果。通过流式细胞术定量细胞内 ROS 水平，结果显示 Se@GL NPs + 超声组和 SeM@GL NPs + 超声组的 ROS 生成量显著增加，与增强的肿瘤靶向性和强效声动力活性一致。这些结果与激光共聚焦显微镜观察结果一致，进一步证实了强大的声动力治疗效果。通过 Annexin V-FITC/PI 双染色和流式细胞术进一步评估 GL261 细胞的凋亡情况，结果显示 SeM@GL NPs + 超声组的凋亡率显著高于其他所有组，与显著的肿瘤杀伤效果相符。研究还通过划痕实验评估 CXCR4 靶向肽对 GL261 细胞迁移能力的影响。Se@GL NPs 或 SeM@GL NPs（均含 CXCR4 靶向肽）处理组的肿瘤细胞迁移能力显著低于不含 CXCR4 靶向肽的其他组。同样，在 Transwell 侵袭实验中，Se@GL NPs 组和 SeM@GL NPs 组的肿瘤细胞侵袭能力显著受抑，与划痕实验结果一致。为明确胶质瘤细胞膜和 CXCR4 靶向肽各自的作用，研究增设两个对照组：仅包裹 GL261 细胞膜的 SeM@G NPs 和仅修饰 CXCR4 靶向肽的 SeM@L NPs。数据显示，在抑制肿瘤细胞迁移方面，CXCR4 靶向肽发挥主导作用，而非 GL261 细胞膜，这与 CXCR4 调控肿瘤迁移的已知功能一致。综上，这些结果表明，CXCR4 靶向肽的功能化修饰显著抑制了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，从而可能限制癌细胞的扩散。
胶质母细胞瘤小鼠的体内荧光成像
鉴于 SeM@GL NPs 具有优异的细胞靶向性和治疗性能，研究进一步评估了其在体内的肿瘤蓄积能力和治疗潜力。通过向小鼠脑内接种表达荧光素酶的 GL261 细胞（GL261-Luc），建立原位胶质母细胞瘤小鼠模型。接种 6 天后，在荷瘤小鼠脑部观察到强且均匀的生物发光信号，证实肿瘤接种成功。胶质母细胞瘤模型建立后，通过尾静脉注射向 GL261 荷瘤 C57BL/6N 小鼠体内分别给药 SeM NPs、SeM@G NPs、SeM@L NPs 或 SeM@GL NPs。随后在预设时间点使用活体成像系统（IVIS）对小鼠进行成像，以 TB-Se 的近红外（NIR）荧光作为纳米颗粒追踪的信号读数。结果显示，所有纳米颗粒处理组均在肿瘤部位检测到近红外荧光信号，且信号强度随时间逐渐升高，在注射后约 12 小时达到峰值，这表明该时间点是体内成像和治疗干预的最佳窗口。值得注意的是，SeM@GL NPs 组的脑肿瘤信号最强，其次是 SeM@G NPs 组和 SeM@L NPs 组；相比之下，既无 GL261 细胞膜包裹也无 CXCR4 修饰的 SeM NPs 组，其肿瘤蓄积能力最弱。这些结果表明，GL261 细胞膜包裹与 CXCR4 靶向肽修饰相结合，可增强纳米颗粒的血脑屏障（BBB）穿透能力和胶质母细胞瘤靶向效率。即使在注射后 24 小时，仍能在肿瘤部位清晰检测到 SeM@GL NPs 产生的强近红外荧光，这凸显了其在体内的肿瘤滞留能力和成像潜力。所产生的近红外荧光信号可清晰显示肿瘤位置，为后续超声治疗提供了可靠依据。注射后 24 小时，处死小鼠并收集主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和大脑），使用 IVIS 进行离体成像。正如预期，由于网状内皮系统（RES）的摄取作用，在肝脏中观察到大量纳米颗粒蓄积；有趣的是，SeM@GL NPs 处理组小鼠脑部的近红外荧光信号显著高于其他所有组，这与体内成像结果一致。这些结果证实了 SeM@GL NPs 具有增强的血脑屏障穿透能力和胶质母细胞瘤靶向效率。对粪便和尿液信号的分析表明，SeM@GL NPs 在一周内主要通过胆汁途径清除。
受 SeM@GL NPs 在细胞水平上展现出的强效杀瘤活性和免疫激活能力的启发，研究进一步在原位胶质母细胞瘤（GBM）小鼠模型中探究其治疗效果。为优化体内治疗的超声（US）参数，研究对荷瘤小鼠采用了不同的超声照射时长（2、5 或 8 分钟；频率 1.0 MHz、功率密度 1.0 W・cm⁻²、占空比 40%）。在肿瘤接种 6 天后，小鼠静脉注射 SeM@GL NPs，随后按设定时长进行超声照射。经过 4 个治疗周期后，通过活体成像系统（IVIS）对表达荧光素酶的 GBM 细胞进行生物发光成像，以监测肿瘤进展。结果显示，将照射时长从 2 分钟增加到 5 分钟时，肿瘤抑制效果显著增强；而进一步延长至 8 分钟，仅能带来微弱的额外获益。因此，后续体内实验选择 5 分钟的超声照射时长。随后，研究系统比较了不同制剂的治疗效果。在肿瘤接种 6 天后，将荷瘤小鼠随机分为 7 组（每组 5 只小鼠），分别接受以下治疗：G1（PBS）、G2（M NPs）、G3（Se NPs + 超声）、G4（SeM NPs + 超声）、G5（Se@GL NPs + 超声）、G6（SeM@GL NPs）、G7（SeM@GL NPs + 超声）。在静脉注射相应纳米制剂 12 小时后，对设定的超声治疗组小鼠进行超声照射（功率密度 1.0 W・cm⁻²、频率 1.0 MHz、占空比 40%、时长 5 分钟）。治疗方案在第 6、10、14 和 18 天重复进行，并通过 IVIS 生物发光成像监测肿瘤进展。与所有其他组相比，接受 SeM@GL NPs 联合超声治疗的小鼠，其肿瘤抑制效果最为显著。SeM NPs + 超声组和 Se@GL NPs + 超声组虽表现出一定的肿瘤抑制作用，但在第 17 天时肿瘤出现快速生长；而其余 4 组则均呈现出快速的肿瘤进展趋势。这些结果表明，SeM@GL NPs 联合超声的联合治疗策略具有更优异的治疗获益。在整个治疗期间，研究还记录了小鼠的体重变化，以评估全身毒性和整体健康状况。值得注意的是，仅 SeM@GL NPs + 超声组的小鼠体重有所增加；相反，其他组小鼠的体重要么无显著变化，要么逐渐下降，这可能是由于胶质瘤增殖和侵袭引发的脑功能障碍所致。
结论
本研究开发了一种多功能超声（US）激活纳米平台，该平台通过协同整合声动力治疗（SDT）、STING 通路激活与 CXCR4 抑制功能，成功突破了胶质母细胞瘤（GBM）的免疫抑制屏障。通过对三种仅存在细微原子取代差异（即 O、S、Se）的有机分子进行系统比较，我们发现了一种新型含硒化合物，其具有优异的声动力性能。研究将这种高性能声敏剂与活性氧（ROS）响应型 STING 激动剂前药共同包载于纳米颗粒（NPs）中，并进一步对纳米颗粒进行胶质瘤细胞膜包裹和 CXCR4 靶向肽修饰。这种双靶向设计 —— 借助同源膜伪装和 CXCR4 介导的递送机制 —— 在提升纳米颗粒肿瘤蓄积量的同时，最大限度降低了脱靶效应。强效的声动力治疗效果与自加速的 STING 激动剂激活作用相结合，显著增强了先天免疫与适应性免疫应答。此外，CXCR4 靶向肽的引入可破坏 CXCL12/CXCR4 信号轴，从而抑制肿瘤进展与免疫逃逸。这种协同免疫治疗策略不仅能激发强效抗肿瘤免疫应答，有效抑制原发肿瘤生长，还能抑制术后复发，显著延长荷 GBM 小鼠的生存期。该整合型纳米平台不仅可实现强效的先天免疫与适应性免疫激活，还能显著抑制荷 GBM 小鼠的肿瘤生长与复发，为针对这一致命恶性肿瘤的高效、精准免疫治疗提供了有力的临床前证据。
参考文献
A Sono-Responsive Nanoplatform Integrating STING Activation and CXCR4 Blockade for Synergistic Immunotherapy of Glioblastoma，Xiaoying Kang, Wenwen Chen, Yuan Zhang, Jingyi Ma, Zekun Du, Xiaodong Chen, Ji Qi,* Zhimou Yang,* and Xian Shen*，Adv. Mater. 2025, e12104，https://doi.org/10.1002/adma.202512104
