内容提要
由于缺乏有效的声敏剂，声动力学疗法（SDT）的临床前景尚未明确。本文中，作者设计了酞菁-青蒿琥酯偶联物（例如：ZnPcT4A），其可以产生高达约100 μ g/ml的蛋白质比已知的声敏原卟啉IX多一倍的活性氧（ROS）。同时，聚集增强声动力活性（AESA）首次观察到一个有趣的发现。ZnPcT4A在水溶液中聚集形式比解聚形式生成约60倍高的声动力学ROS。这可能因为纳米结构的超声空化增强。AESA效应的大小取决于声敏剂分子的聚集能力及其聚集体的粒径。此外，生物学研究表明ZnPcT4A具有较高的抗癌活性和生物安全性。本研究为开发高效的有机声敏剂开辟了一条新的途径。
作为光敏剂的酞菁锌（ZnPcs）由于其从单重态到三重态的高转换效率而表现出高效的光动力学活性氧产生。ZnPcs具有这些独特的性质，是一种很有前景的声敏剂。然而，用于声敏剂的ZnPcs仍然不常见。另一方面，近年来，我们发现青蒿素衍生物具有声动力学活性。因此，我们将ARS引入到ZnPcs上，制备共价酞菁-青蒿琥酯缀合物（ZnPcTAs），期望通过ZnPcs和ARS的结合获得新型高效的有机声敏剂。为了获得更有效的ARS结合效果，设计了ZnPc与4个ARS单元缀合，即ZnPcT4A。同时，ZnPcs与2个ARS单位和1个ARS单位（即，ZnPcT2A和ZnPcT1A）也被制备作为对照。
通过ARS和用1-、2-和4-三甘醇单元改性的ZnPc的酯化反应制备ZnPcT1A、ZnPcT2A和ZnPcT4A。分别与1-乙基-3-甲基-N-（2-甲基-2-苯基）-N-（2-甲基苯基）-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和4-（二甲基氨基）吡啶（DMAP）在N，N-二甲基甲酰胺（DMF）或CH2Cl2中的溶液。ZnPcT1A、ZnPcT2A和ZnPcT4A如先前报道的那样合成。通过1H NMR和HRMS表征这些偶联物。
通过光谱方法对这些共轭物的性质进行了评估。ZnPcT4A在DMF中在696 nm处显示出尖锐且强烈的Q带吸收，并且在710 nm处显示出强的荧光发射，表明ZnPcT4A为单体形式。与DMF中的光谱相比，ZnPcT4A在水中显示出宽且低的Q带，表明其是聚集的。同时，由于聚集引起的淬灭（ACQ）效应，其具有非常弱的荧光发射。在CEL（0.5- 2%，0.5- 2g/100 mL水）存在下，ZnPcT4A的Q带变得更尖更高，荧光强度也增加，表明ZnPcT4A在CEL存在下部分解聚。对于ZnPcTlA和ZnPcT2A也观察到类似的结果。ZnPcT4A的前体ZnPcT4表现出比ZnPcT4A在水中更宽的Q带，这意味着ZnPcT4在水中更聚集，但在CEL存在下，特别是在2%CEL存在下，根据UV-vis和荧光光谱，ZnPcT4几乎解聚成单体。
用动态光散射（DLS）法研究了水溶液中的聚集尺度和解聚集。ZnPcT4A在水中形成纳米结构的聚集体，显示出平均尺寸为约135 nm的单峰尺寸分布，但ZnPcT4的聚集体为多峰尺寸分布，并且其主要分布峰较宽，平均尺寸较大（约306 nm）比ZnPcT4A。结果表明，由于ARS的引入，ZnPcT4A在水中可以聚集成纳米结构。然而，在CEL存在下，ZnPcT4A的纳米结构随着CEL的增加逐渐变成较小的聚集体或单体。对于ZnPcT4，原始纳米结构在2%CEL水溶液中消失。对于ZnPcT1A和ZnPcT2A观察到ZnPcT4A的类似结果，其在水中呈现均匀的纳米结构聚集体，并且在CEL水溶液中呈现不同程度的解聚。透射电子显微镜（TEM）观察到ZnPcT4A在2%CEL水溶液中发生了明显的解聚。ZnPcT4A在水中的形态是平均尺寸为约100 nm的均匀球形结构，而在2%CEL存在下，ZnPcT4A的纳米结构塌陷成小得多的碎片。此外，通过DLS测量在不同浓度下证实了ZnPcT4A在水中的纳米结构。ZnPcT4A在不同浓度（5-100 mM）下仍保持单峰尺寸分布，具有相当的尺寸（135-145 nm）。ZnPcT4A的粒径在24小时内几乎没有变化，但在相同条件下ZnPcT4的粒径显著增大。ZnPcT4A也保持纳米结构的聚集体并且在超声处理下是稳定的，而ZnPcT4不是这种情况。结果表明，ARS的引入显著提高了ZnPcT4A的聚集成纳米结构的能力和纳米结构的稳定性。此外，ZnPcT4A在生理盐水、磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH=7.4）和DMEM细胞培养基的生理溶液中仍然是均匀的纳米结构聚集体，具有与在水中相似的尺寸。
使用2，7-二氯荧光素（DCFH）作为探针，在水溶液中评价它们在超声处理后的ROS生成。ZnPcT4A和其他化合物（ZnPcT1A、ZnPcT2A和ZnPcT4A）在超声处理（1 MHz，1.5Wcm-2）时可以在水中有效地产生ROS，尽管它们在水中聚集。为了进一步证明聚集行为对声敏活性的影响，在具有不同量的CEL的水溶液中比较它们的ROS产生。在含有CEL的水溶液中，聚集体解聚，尤其是ZnPcT2A和ZnPcT4A，其几乎完全解聚成单体。因此，它们在超声下的ROS生成显著减少，甚至基本上消失。其中，ZnPcT4A是最突出的，其在聚集状态下比解聚状态下表现出高约60倍的ROS产生。结果表明，聚集可以增强声动力学活性氧的产生。另一方面，由于ACQ效应，ZnPcT4A在水中的光动力学活性氧显著低于在2%CEL水溶液中。也就是说，敏化剂分子在聚集体中的紧密堆叠导致高度频繁的分子间碰撞，其淬灭荧光和系间交叉。然而，它仍然具有一定的光动力ROS能力。
使用9，10-蒽二基-双（亚甲基）-二丙二酸（ABDA）作为探针，在这些不同的水溶液中进一步评价了在超声下ZnPcT4A的单线态氧产生。在CEL，特别是2%CEL的存在下，ABDA的吸光度几乎不随超声处理时间变化，表明没有明显的单线态氧产生，而ZnPcT4A的单线态氧在水中显著增强。结果与活性氧产生的结果吻合较好，进一步验证了AESA效应。其他类型的活性氧，包括超氧阴离子（O2·-）和羟基自由基（OH·），也进行了检查。O2·-的猝灭剂为1，4-苯醌（BQ）与四氢呋喃DCFH。在BQ存在下，DCFH的荧光强度几乎没有变化，这意味着没有产生O2·-。以亚甲基蓝（MB）为探针，测定OH·。同样，超声处理后未发现OH·。结果表明，单线态氧是ZnPcT4A声动力学活性氧的主要来源之一。
重要的是，我们发现，当ZnPcT4A的水溶液被超声处理时，出现了大量的空化气泡。利用高速摄像机在显微镜的帮助下对空化气泡的形成、生长和破裂过程进行了直观观察。然而，对照（仅水，无ZnPcT4A）和在0.5%和2.0%CEL水溶液中的ZnPcT4A的情况下，在相同的测量中仅产生很少或很少的空化气泡。因此，作者推测，与CEL水溶液中的解聚状态相比，ZnPcT4A在水中的纳米结构聚集体可以促进超声处理后成核位点的产生，并增强超声空化效应，从而导致ROS产生的增强。
在常见的声敏剂Ce6和PpIX上进一步验证了聚集增强的声动力学ROS产生。比较了它们在不同水溶液中的光谱性质、DLS粒径和活性氧生成情况。在水中，Ce6和PpIX均显示聚集的吸收光谱，并且它们的荧光发射显著淬灭。同时，它们在DLS分析中显示出不规则的粒度分布。在CEL的存在下，特别是在2%CEL的存在下，它们基本上解聚成单体。观察到Ce6和PpIX的聚集增强声动力ROS产生的类似趋势。根据实验结果，我们认为AESA效应是大多数声敏剂的普遍现象，这将在我们未来的工作中得到进一步的证实。
此外，所有声敏剂在水中呈现不同的ROS产生效率，尽管它们都显示出聚集增强的声动力学ROS。ZnPcT4A具有最高的ROS产生，其次是ZnPcT2A和ZnPcT1A，其具有一定ROS产生。所有这些偶联物在水中显示出相似的纳米结构聚集体。ZnPcT4（其在水中相对于缀合物为较大且不均匀的聚集体的效率低于这些偶联物，而Ce6和PpIX（其呈现为不规则且较大的聚集体）是最低的。ZnPcT4A的活性氧产生量高达约1000 mg比PpIX高一倍。对于增加的聚集增强的ROS水平，这些声敏剂遵循ZnPcT4A（60倍）>ZnPcT2A（44倍）>ZnPcT1A（35倍）>ZnPcT4（17倍）>Ce6（10倍）>PpIX（4倍）的趋势，这与它们在水中的ROS产生效率的趋势一致。因此，我们认为，虽然聚集可以引起声动力学活性氧产生的增加，增加的水平是密切相关的聚集体的形式。具有适当尺寸的均匀纳米结构聚集体，如偶联物ZnPcTAs，更有利于增强ROS的产生，而具有较大和不规则颗粒尺寸的ZnPcT4，Ce6和PpIX显示出较低的效率。此外，与ZnPcT4相比，ZnPcT4A的显著更高的ROS产生是由于其更好的纳米结构聚集体以及ARS的额外的声动力活性。
基于ZnPcT4A优异的ROS生成，我们进一步评估了其在体外和体内水平的声动力学抗癌活性。同时，考虑到酞菁锌（II）固有的光敏特性，以及ZnPcT4A具有一定的光动力ROS能力的观察结果，还检查了其PDT效应以及SDT和PDT的联合效应（即SPDT）。首次采用MTT法测定ZnPcT4A的抗肿瘤活性。在没有光或超声照射的情况下，ZnPcT4A在检测浓度下对HepG2细胞没有表现出明显的细胞毒性。然而，可以观察到ZnPcT4A的声细胞毒性和光细胞毒性，并且声细胞毒性（IC50 = 2.0 mM）比光细胞毒性（IC50 =7.6 mM）显著更有效。这一结果与上述ROS产生的结果一致。此外，对于组合SPDT处理，细胞毒性（IC50 =0.7 mM）相对于声细胞毒性和光细胞毒性进一步增加。通过计算组合指数（CI）来评估SPDT的协同效率。ZnPcT4A表现出SPDT的有效协同作用，CI值为0.5。从Calcein-AM/PIlive-dead细胞染色可以发现，SDT处理后，死亡细胞明显多于PDT处理后，当它们经过SDT和PDT的联合处理时，细胞基本死亡。MTT法和活-死细胞染色结果均表明，ZnPcT4A对HepG2细胞的声动力活性高于光动力活性，SDT和PDT联合应用能有效提高其抗肿瘤疗效。此外，以2'，7'二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）为探针，研究了不同处理对ZnPcT4A细胞内ROS生成的影响。ZnPcT4A可以在用光、超声或联合疗法（SPDT）照射后以不同的效率诱导HepG2细胞中的ROS产生。细胞内活性氧产生效率的变化趋势为SPDT > SDT > PDT，与细胞毒作用的结果相吻合。
采用H22荷瘤小鼠模型研究了ZnPcT4A的体内抗肿瘤作用。荷瘤小鼠通过静脉内给药，然后超声处理或/和光照射进行治疗。为了证明超声的穿透深度，在超声处理下，还在小鼠（即ZnPcT4A+US+猪肉）的肿瘤部位覆盖5 mm切片猪肉。所有治疗组（ZnPcT4A +US、ZnPcT4A +L、ZnPcT4A +US+猪肉、ZnPcT4A +US+L）显示不同程度的肿瘤生长抑制。SDT组肿瘤生长明显慢于PDT组，提示声动力学抗肿瘤效应优于光动力学效应，与细胞毒作用结果一致。正如预期的那样，SPDT联合用药具有最高的抗肿瘤疗效。用SPDT处理的小鼠的肿瘤在14天内几乎不生长，肿瘤生长抑制率为98%。另一方面，对于覆盖猪肉片的病例，治疗效果与不覆盖猪肉片的病例相当，表明超声可以穿透猪肉片并治疗更深的肿瘤组织。在此期间，所有小鼠组的体重均轻微增长，表明所有处理均无可见的全身毒性。此外，苏木精和伊红（H&E）染色进一步证明ZnPcT4A对肿瘤细胞造成严重损伤，但在SDT或SPDT处理后没有可见的器官损伤。此外，ZnPcT4A没有表现出明显的溶血行为，计算其溶血率为（1.21±0.02）%，低于5%。结果表明，ZnPcT4A的全身毒性可忽略不计，具有生物安全性。ZnPcT4A具有较高的生物安全性、协同SPDT效应和高效的抗癌活性，有望成为治疗深部肿瘤的增敏剂。
总结
总之，我们开发了三乙二醇取代的酞菁锌（II）（ZnPcTs）和ARS的三种两亲性共价缀合物（ZnPcT1A、ZnPcT2A和ZnPcT4A）。这些缀合物在水中形成纳米结构的聚集体，这导致聚集增强的ROS产生。AESA效应可归因于纳米结构的超声空化效应。AESA效应的大小与声敏分子的聚集能力和聚集体的粒径大小密切相关。此外，ZnPcT4 A的生物学研究表明，ZnPcT4 A具有较高的生物安全性、高效的SDT抗癌功效和协同SPDT效应，肿瘤生长抑制率达98%。更重要的是，这种现象也可以在其他声敏剂上观察到，包括ZnPcT4，Ce6和PpIX。因此，我们认为AESA效应是大多数有机声敏剂的普遍现象。本研究首次发现的AESA效应改变了设计声敏剂时避免聚集的原有思路，为高效有机声敏剂的开发开辟了新的途径。
参考文献
Aggregation-Enhanced Sonodynamic Activity of Phthalocyanine–Artesunate Conjugates. Peng-Hui Zhao, Yu-Lin Wu, Xue-Yan Li, Lin-Lin Feng, Ling Zhang, BiYuan Zheng, Mei-Rong Ke,* and Jian-Dong Huang*. Angew. Chem. Int. Ed. 2022, 61, e202113506. https://doi.org/10.1002/anie.202113506.
