内容提要
无创声动力学疗法（SDT）由于超声的深层组织穿透能力（>10 cm）和高空间分辨率而显示出治疗脑胶质瘤的前景。然而，这种技术受到活性氧（ROS）的低效产生的阻碍，这是由缺氧的肿瘤微环境（TME）、高水平的ROS清除剂谷胱甘肽（GSH）引起的，并且不能在体内可视化胶质瘤以进行精确的治疗管理和监测。为了解决这些困难，我们制造了核-壳异质结构声致敏剂（标记为DFM），其中meso-（4-羧基苯基）四卟啉（TCPP）卟啉金属有机框架（MOF，PCN-224（Fe））用作多孔壳以包含批准的化疗药物索拉非尼（SRF）以有效抑制GSH合成，而NaErF 4：Yb@NaLuF4纳米颗粒作为核在1525提供TME响应性NIR IIb（λ 1500-1800 nm）发光以用于精确的光学成像。发现Fe3+配位到TCPP的大环中，除了触发铁凋亡外，还降低TCPP磷光（降低23%）并增加三重态（T1）氧猝灭，显著促进单线态氧的产生（增加2.6倍）。此外，TME中的GSH促进Fe3+还原为Fe2+，从而消除Fe3+的发光猝灭，增强Er 3+的近红外IIb发光（增加5倍），用于颅内胶质瘤纳米药物积聚成像，实现SDT过程的动态监测。与对照组相比，体外和体内实验证实了有效的ROS产生，并导致脑胶质瘤体积减少6倍，治疗后30天的存活率达到80%。
结果与讨论
描绘了DFMSL纳米平台的合成过程。初始步骤涉及原位生长（[PCN 224（Fe）]）以制造DSNPs@MOF（DFM）。随后，将索拉非尼（SRF）化疗药物和靶向乳铁蛋白（LF）负载并修饰以产生最终产物DSMFL。NaErF 4：Yb核纳米颗粒、NaErF 4：Yb@NaLuF4（DSNP）和DFM的透射电子显微镜（TEM）图像。NaErF 4：Yb核纳米粒子和DSNPs均为六方结构，尺寸分别为34.5 ± 1.1 nm和46 nm ± 1.3 nm。在MOF包覆过程之后，纳米颗粒的直径增加到52.3 ± 2nm，并且可以清楚地观察到DFM的核-壳结构，从而证实成功包覆。通过HADDF和元素分布图以及EDS分析进一步证实了DFM的组成和核-壳结构，显示了Er、Zr、Fe、F、Yb和Lu的存在。进行动态光散射（DLS）测定以确定水性分散体中纳米颗粒的尺寸，并且流体动力学直径从透水DSNP的71 nm增加到DFM的108 nm，为MOF的有效修饰提供了证据，。通过DLS测量来评估DFMSL NP在PBS（磷酸盐缓冲盐水）、SBF（模拟体液）、FBS（胎牛血清）、培养基中的稳定性。
在48小时内未观察到流体动力学粒度的显著变化，表明DFMSL NP的优异稳定性。对于DFMSL NP，测量多分散指数（PDI）为0.172（PBS）、0.193（SBF）、0.242（FBS）和0.273（培养基），对于DFM NP，测量多分散指数（PDI）为0.169（PBS）、0.187（SBF）、0.235（FBS）和0.267（培养基），对于DSNP NP，测量多分散指数（PDI）为0.147（PBS）、0.151（SBF）、0.162（FBS）和0.191（培养基），验证了所研究溶液中的单分散性。
Fe、F、0、C、Y和Yb的X射线光电子能谱（XPS）结果，其证实了DFM的成功合成。测定Fe3 +/Fe2+比率为48.5%：通过分析高分辨率Fe2p XPS光谱，在DFM NP与含有10 mM 的GSH和0. ImM的H2 O2的模拟TME在pH 6.0下反应之后，DFM NP的还原性为51.5%。这些发现证明了DFM NP的显著GSH消耗能力。X射线衍射（XRD）图谱确认了由α相DSNP和[PCN-224（Fe）] MOF组成的DFM组成的验证。值得注意的是，在图中未检测到杂质。DFM NP的表面用SRF和LF进行表面钝化以产生最终的DFMSL，随后使用DLS测定通过ζ电位测量来验证。图S4 a，显示DFM显示负电位为-15.2 mV。在加载带正电荷的LF和SRF后，观察到DFMSL的ζ电位降低至-12.4mV，表明LF和SRF的成功加载。通过估计溶液中添加的SRF和溶液中截留的SRF的吸收差异，确定SRF的载量为71.7%。模拟体液（SBF）中SRF的非特异性泄漏在10小时后被确定为约9%，此时在IV注射后进行SDT治疗。这表明DFMSL中的大部分SRF保留在DFMSL中用于肿瘤化疗。DSNP和DFM的发射强度和寿命。具体地，在MOF涂覆后，DSNP在1525 nm处的发射强度降低了82.2%，这可能是由于Fe3+的发光猝灭效应。进行时间分辨光致发光测定以验证DSNP和DFM之间的能量转移。从DSNP到MOF壳的能量转移效率被确定为20.2%，如在1525下的寿命从DSNP的2.23 ms减少到DFM的1.78 ms所证明的。
DFM中的拓扑结构（左）（[PCN 224（Fe）]）MOF壳的3D框架，以说明其与水和O2分子的相互作用，从而引发ROS生成。在超声辐照下，由于超声空化效应，Fe-TCPP在超声波作用下产生·OH和1 O2。观察到存在于MOF壳中的Fe3+催化H2 O2为O2，并减少GSH（天然ROS清除剂）向GSSG的过表达，从而放大ROS毒性并减轻活细胞中的肿瘤缺氧，而不通过肿瘤细胞代谢。Fe3+对发光有猝灭作用，猝灭效率为97%，而Cu 2+、Cr 3+和Ag +的猝灭效率分别为30%、26%和20%。相反，Fe2+离子对发光的影响可以忽略不计。结果表明，GSH部分还原Fe3+为Fe2+，减弱了Fe3+的荧光猝灭效应，恢复了Er 3+的NIR-IIb发光。(增强5倍，右侧所示）。
Fe-TCPP（在DFMSL中）和O2的简化能级以及所涉及的三重态能量转移过程。在被US激发时，DFM经历从其单重基态S0到激发单重态的转变。随后，通过非辐射弛豫，它迅速衰减到第一激发单重态S1的最低能级。在此之后，分子通过系间穿越过程（ISC）转变到第一激发三重态T1后，DFM可以通过两个主要途径弛豫到S0，包括磷光和将能量转移到O2，称为O2猝灭过程以产生1O2。根据这一原理，竞争之间的磷光和O2猝灭过程。因此，必须降低磷光的强度，以促进更多能量转移到O2猝灭过程，从而产生增强的1O2。有趣的是，已经观察到Fe元素表现出磷光猝灭效应，这可能导致1O2的稳健生成。
与TCPP相比，Fe与TCPP的络合诱导了对磷光的猝灭效应，并导致弱得多的磷光（约23%降低）。为了探讨脱胆碱在磷光中是否会引起1O2的增强，通过DPBF的降解来证实TCPP和Fe-TCPP在US照射下的1O2产生能力。在10分钟内由Fe-TCPP引起的DPBF的47%降低高于TCPP的19%，证明了由Fe引起的1O2产生的2.6倍增强增加。TCPP与Fe的络合物可以很容易地降低磷光发射，从而可以被环境中的O2分子有效地猝灭。
进行电子自旋共振光谱（ESR）测量以验证ROS的产生。在DFM中观察到指示·OH（峰强度为1：2：2：1）和1 O2（峰强度为1：1：1）的ESR信号。值得注意的是，包括H2 O2显著增强了·OH（2.24倍增强）和1 O2（2.1倍增强）的信号强度。Fe3+能有效地分解H2O2，产生O2，从而促进了1O2的生成。此外，观察到外部US刺激加速中间络合物向Fe2+的转化，随后引发US增强的·OH产生的显著增加，其原理如下
然后分别以亚甲基蓝（MB）和1，3-二苯基异苯并呋喃（DPBF）为催化剂，研究了·OH和1O2的产生情况。DFM + US组的吸收曲线显著降低，证实了DFM在US辐照下产生·OH。DFM加US和H2O2组显示出显着的减少，这是由于US诱导的Fe3+和H2O2之间的反应。与其他组相比，DFM与US和H2O2联合给药的组显示出最低的DPBF峰，这是由于H2O2被CAT模拟物Fe3+分解的结果。
此外，我们还用5，5 ′-二硫代双-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）评价了DFM对GSH的去除能力。将DFM NP与GSH水溶液（10mM）以不同的时间间隔（0、10、15、30 min）混合，并通过与DTNB反应以产生在412 nm处具有特征峰的TNB来定量剩余的GSH。随着反应时间的增加，观察到在412 nm处的明显降低，表明DFM的GSH消耗能力。此外，通过对Er 3+在1525 nm处的NIR-IIb发光的研究，证明了DFM的GSH响应性发光恢复特性。DFM PBS与GSH反应后的插图照片显示出由于Fe3+还原而更浅的颜色。DFM在1525 nm处的NIR-IIb发光随GSH浓度（0、2、4、6、8、10、12 mM）的增加而线性增强，证明DFM具有GSH响应性发光恢复，具有在体内应用的潜力。照片描绘了与GSH反应后的DFM PBS溶液，其由于Fe3+还原而表现出较浅的颜色。为了研究US对催化活性和GSH消耗的影响，进行了O2生成和DTNB实验。这些实验的结果表明，DFM加H2O2的O2生成量在10分钟点时从9 mg mL−1增加至13 mg mL−1，表明US辐照导致催化活性增强。此外，DFM纳米颗粒的DTNB减少比率在US照射后表现出从25%至60%的显著增加，从而验证了US照射的增强影响。总之，该研究提出DFM NP具有产生ROS和消耗GSH的能力，从而表明其用于体内应用的潜在效用。
呈现了概念验证，其中DFMSL NP被导向C6细胞并通过US照射刺激以产生ROS。随后的ROS产生导致GSH耗尽和溶酶体逃逸，从而能够释放SRF。反过来，SRF通过抑制系统XC-途径阻碍GSH合成，导致持续和全面的GSH耗竭。该过程放大了ROS毒性并上调了LPO，最终加强了铁凋亡。在体内应用抗癌DFMSL纳米颗粒之前，必须确定细胞对这些纳米颗粒的吞噬特性。为此，本研究将C6细胞与DFMSL NP孵育不同的持续时间（30、60和90分钟）。其通过利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）图像评估了细胞对纳米颗粒的内化。该研究的发现表明，当被405 nm激光激发时，DAPI可以发射蓝色荧光以标记细胞核，而TCPP发射红色荧光（伪色出现在图中）。随着培养时间从30分钟延长到90分钟，细胞质内的红色荧光强度增加。该观察结果表明C6细胞对DFMSL NP的更大摄取（顶部）。通道的整合和相对3D表面图的生成提供了内化过程的更全面的描述（底部）。通过从添加的DFMSL浓度中减去上清液中的DFMSL浓度来确定内吞效率。而DFMSL浓度通过含纳米颗粒的Er浓度（通过ICP-MS测试测定）获得。DFMSL在癌细胞中的时程内吞效率分别计算为26.7%（30 min）、42.2%（60 min）和59.3%（90 min）。
DFMSL NP穿过血脑屏障（BBB）的能力对于它们的体内应用是重要的。为此，我们建立了一个血脑屏障模型来研究DFMSL穿越血脑屏障的能力。脑血管内皮细胞在transwell的下腔室中培养和增殖，而C6大鼠神经胶质瘤细胞在transwell的中腔室中的介孔层上培养，用作屏障层。在上部transwell中出现的DFMSL NP的数目与transwell中纳米颗粒的总数的比率用于量化BBB交叉能力。结果发现，DFMSL加US组的累积转运率为15.3%，高于DFMSL组（13%）和DFMSL组（8%）。这些结果给予了LF和US照射有助于纳米颗粒穿过BBB的明确证据。
为了评估DFMSLNP与L929成纤维细胞的生物相容性，执行标准MTT测定。结果表明，即使在500 yg mL-1的浓度下，L929细胞也保持高水平的活力（90%），验证了DFMSL NP的低毒性。随后，进行可比较的测定以检查DFML和DFMSL NP针对C6细胞的抗肿瘤有效性。数据证明样品浓度（DFML和DFMSL）与细胞致死率呈正相关。DFMSL和US的组合导致最高的死亡率（在100 μgmL-1的DFMSL浓度下，细胞的活力降低至18%），表明使用SDT与化疗结合是有效的治疗策略。
使用香豆素-3-羧酸和单线态氧传感器绿色（SOSG）测定试剂盒检测US辐照下·OH和1O2的体外生成。与无US组相比，接受US照射的组显示出明显的荧光信号，表明细胞内产生·OH和1O2。本研究利用CLSM图像来评估不同细胞群中脂质过氧化（LPO）的程度。如图3d所示，LPO积累从DFML到最终DFMSL加US逐渐增加，最终导致铁凋亡，这通过蛋白质印迹（WB）测定中GPX 4的细胞内表达减少来证实。表明DFML处理组的WB强度表现出适度的下降，可能是由于肿瘤细胞中GSH的迅速恢复。相反，DFMSL、DFML + US和DFMSL + US组在WB中表现出逐渐变弱的灰度，表明活性GSH的有效消耗。在这项研究中的细胞内产生的ROS进行了调查。用钙黄绿素（AM，绿色荧光）和碘化丙啶（PI，红色荧光）染色活/死3D球形C6细胞以验证ROS的致死性（顶部）。底部所示的结果表明，从组DFML到DFMSL加上US的PI的红色荧光的增加证实了由产生的ROS引起的死亡。这些发现强调了Fe3+和SRF通过提高O2水平和抑制GSH合成来增强ROS产生的显著贡献。
随后，通过flysotracker绿色和CLSM图像评估内体容量。发现TCPP的红色发射几乎完全掩盖PBS、DFML NP和DFMSL组中的绿色荧光，Pearson相关系数分别为0.95、0.93和0.87。然而，在DFML加US和DFMSL加US组中，Pearson相关系数分别降低至0.54和0.48，表明US照射后NP的有效溶酶体逃避。值得注意的是，在US照射后，在DFML和DFMSL组中观察到TCPP和lysotracker绿色之间的部分重叠。测量用PBS（对照）和DFMSL NP加US处理的细胞的生物-TEM图像并显示在图中。在对照组中观察到正常的线粒体形态（短杆或圆球，红色箭头），而在治疗组（DFMSL NP加US）中观察到线粒体体积的急剧收缩和膜层增厚（蓝色箭头），证实了铁凋亡的发生。JC-1染色用于指示线粒体膜电位（MMP）的改变，其可用于表征细胞凋亡。健康细胞中的线粒体呈现红色聚集，而死亡细胞中的线粒体呈现膜电位降低，如线粒体中绿色单体的出现所证明的。绿色与红色比率的定量使得能够表征细胞凋亡。在处理组中观察到绿色/红色比率以PBS<DMFL<DFMSL< DMFL+US< DFMSL+US的顺序逐渐增加。这些结果清楚地表明SRF和US的组合在产生足够量的ROS以使线粒体膜脱铁而导致铁凋亡方面的重要性。图3 h中描绘的流式细胞术结果显示，施加PBS、DFML、DFMSL、DFML + US和DFMSL + US导致不同水平的三元共聚物比率。值得注意的是，用DFMSL加US处理的组出现了最高程度的肿瘤细胞凋亡，如凋亡率从5.3%显著增加到93%所证明的。使用Ru（dpp）2Cl2定量细胞内O2的产生，Ru（dpp）2Cl2发出被O2猝灭的红色荧光。将C6细胞与DFMSL纳米颗粒（100 μg mL−1）共孵育不同的持续时间（0、20、40、60和90 min），导致红色荧光逐渐减少。
在这项研究中，明亮的NIR-IIb成像（1525 nm）被用来调查DFMSL纳米粒子在胶质瘤中的最大积累，并动态检测治疗过程。静脉注射DFMSL NP（10 mg/mL）后，使用InGaAs照相机在不同时间点（1、3、6、8、10、14和28 h）收集NIR-IIb图像。描绘的图像表明，大多数DFMSL NP在1小时内在肝脏中快速积累。随着时间的推移，脑胶质瘤部位的NIR-IIb成像在8小时标记处显示出火花，随后在静脉内给药后10小时达到峰值，从而表明10小时时间点最适合治疗。28小时后，肝脏和肿瘤中NIR-IIb成像的强度逐渐减弱，这表明纳米颗粒被代谢并从小鼠体内消除。为了说明纳米颗粒的LF修饰在体内BBB穿越中的作用，以与DFMSL（10 mg/mL）相同的剂量静脉内注射DFMS NP（无LF修饰）。可以看出，在整个时间段（28小时）内，在用DFMSL（有LF）处理的小鼠肿瘤中总是观察到比用DFMS（无LF）处理的小鼠肿瘤更高的NIRIIb发光，证明LF确实可以增强纳米颗粒的BBB穿过效率。
基于上述有希望的结果，将DFMSL NP的静脉内和瘤内施用与周期性US治疗一起应用于具有胶质瘤的C57小鼠，以呈现US诱导的NIR-IIb发光的恢复。在10小时的时间段以允许在神经胶质瘤部位处的最大富集之后，进行连续2分钟的US照射，并且使用InGaAs相机以20秒的间隔捕获相对的NIR-IIb图像。如预期的，NIR-IIb成像在神经胶质瘤部位表现出进行性增强（与初始测量相比，在第12分钟强度增加5.6倍），从而验证了在US照射下由DFMSL的GSH消耗能力诱导的NIR-IIb成像恢复的功效。类似地，DFMSL NP的肿瘤内施用在US照射后引起肿瘤部位处的NIR-IIb成像强度的迅速升级，导致与基线相比在第12分钟的NIR-IIb成像强度的12倍放大，因此证实了通过US刺激促进的体内NIR-IIb成像的可行性。相反，在没有US照射的情况下肿瘤内注射DFMSL NP的小鼠表现出NIR-IIb成像强度的边际增加（1.53倍），从而验证了US照射在增加Fe3+的GSH消耗潜力和加速NIR-IIb成像恢复中的作用。
C6神经胶质瘤异种移植研究的实验图和结果。在治疗开始前10天的肿瘤孵育期后，在第1天和第8天进行常规超声诱导治疗。在第14天，将所有小鼠安乐死，并收集其主要器官用于免疫组织化学分析。来自不同组的肿瘤的生物发光图像表明，DFMSL加US照射在治疗期间表现出最有效的抑制作用。虽然DFML加US对肿瘤生长也有一定的影响，但效果不如无SRF。整个脑的组织学分析（H&E）证实DFMSL加US组具有最小的肿瘤尺寸，与生物发光结果一致。随后确定肿瘤的重量比，考虑PBS、DFML、DFMSL、DFML + US和DFMSL + US的百分比，其分别为100%、90%、83%、40%和20%。这些发现提供了DFMSL NP与US照射结合的治疗功效的令人信服的证据。在治疗过程中，监测荷瘤小鼠的相对肿瘤体积。PBS处理组经历过度生长，导致肿瘤比原始体积大六倍。尽管DFML和DFMSL组表现出特定的抗肿瘤作用，但肿瘤体积继续增加，表明这些治疗不足以产生令人满意的治疗结果。相比之下，DFML NP和US照射的组合导致显著的肿瘤消融，体积比原始体积小两倍。更有希望的是，DFMSL加US照射几乎没有显示肿瘤大小增加（仅比治疗前的原始体积高1.15倍），揭示了DFMSL NP最有效的肿瘤抑制能力。为了进一步研究携带C57的小鼠的存活率，另一组小鼠维持存活以进行存活分析直到第30天。呈现了所有小鼠的记录的存活率，表明虽然DFML NP和DFMSL NP延长了C57小鼠的存活时间，但大多数小鼠在24天内死亡。相比之下，DFMSL NP与US照射联合施用导致小鼠长达30天的显著80%存活率，证明了DFMSL NP在US照射下的有效抗肿瘤功效。
此外，发现US照射穿透更深并促进H2O2分解为O2，从而提高ROS产量并缓解肿瘤缺氧。进行HIF-1 α蛋白测定以证实该假设。蛋白质印迹（WB）结果表明DFML NP处理组表现出较低的值（与PBS组相比为72%）。相比之下，DFMSL NP加US处理组显示出更显著的降低（与PBS组相比为34%），从而验证了由于US照射而导致的O2增强。
为了研究DFML和DFMSL纳米颗粒在携带神经胶质瘤的小鼠中的体内生物相容性，进行苏木精和伊红（H&E）染色，受到其上级的肿瘤抑制的启发。用PBS、DFML NP、DFMSL NP、DFML NP加US照射和DFMSL NP加US照射处理小鼠。与PBS组相比，用最终DFMSL加US照射处理的肿瘤的H&E染色显示稀疏的肿瘤细胞，表明体外一致的治疗效果。在来自DFML和DFMSL的肿瘤组织上进行TUNEL分析，其利用蓝色荧光用于DAPI和绿色荧光用于凋亡/坏死。采用Ki-67抗体作为细胞增殖的指标，以评估不同治疗组中肿瘤细胞的增殖。发现揭示了棕色肿瘤细胞的增殖从对照组（PBS）到最终组（DFMSL加US）逐渐下降，表明治疗方案在诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖方面的功效。在这些组织中观察到的荧光是最小的，但是向DFML中添加US导致绿色荧光的显著增加，证明了有效的肿瘤凋亡。在最终的DFMSL加US组织中观察到最高的绿色荧光，证实了其高抗肿瘤功效。此外，DFMSL +US组织中的GPX 4含量最低，提供了最有效的治疗效果是由于铁凋亡的证据。此外，PBS和其他处理组的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肝脏）的生化和血液分析和H&E染色显示切片中没有可观察到的组织损伤。这些结果表明，合成的DFMSL纳米颗粒具有上级的生物相容性的生物应用。
结论
受NIR-IIb成像引导的肿瘤纳米诊断学快速发展的推动，我们提出了一种有效的自增强声动力学治疗（SDT）胶质瘤的体内方法，该方法由NIR-IIb成像引导，对肿瘤微环境（TME）进行响应，以上调·OH和1O2。本研究中合成的金属有机框架（MOF）涂覆的DSNPs作为有效的声敏剂，通过减少磷光和通过配位的Fe3+将H2O2分解为O2来促进ROS的产生。此外，DSNP可以减少TME中过表达的GSH，导致ROS的延长的氧化毒性和用于SDT过程的动态监测的恢复的NIR-IIb成像。同时，MOF中Fe3+的还原促进了DFMSL近红外IIb成像的恢复，使得SDT过程中能够动态成像。此外，超声诱导的ROS可增加细胞内氧化应激，诱导铁凋亡并触发溶酶体逃逸和化疗SRF的释放。反过来，SRF可以抑制GSH的合成，确保持续的ROS活性，并建立一个正反馈loop.Our研究结果表明，DFMSL纳米复合材料提供了一个可行的方法，产生有效的ROS胶质瘤治疗，突出合作策略的潜力。
参考文献
Metalloporphyrin MOFs-Based Nanoagent Enabling Tumor Microenvironment Responsive Sonodynamic Therapy of Intracranial Glioma Signaled by NIR-IIb Luminescence Imaging. Tao Jia, Jiarui Du, Jiani Yang, Yang Li, Tymish Y. Ohulchanskyy, Xikui Fang, and Guanying Chen. Adv. Funct. Mater. 2023, 2307816. https://doi.org/10.1002/adfm.202307816
