内容提要
共价有机框架（COF）在生物医学应用中引起了越来越多的关注。具有均匀纳米级形态和肿瘤特异性疗效的基于 COFs 的纳米增敏剂的需求量很大；然而，它们的合成仍然具有挑战性。在这项研究中，以受控方式合成了不同的 COF 纳米碗，并将其设计为具有肿瘤特异性声动力学活性的可激活纳米增敏剂。高结晶度确保了 COF 纳米碗的有序多孔结构，可有效装载小分子声敏剂玫瑰红 (RB)。为了避免对正常组织的非特异性损伤，在负载RB的COFs上原位生长的氧化锰(MnOx)特异性地抑制了声敏化效应。在与肿瘤过表达的谷胱甘肽 (GSH) 反应后，“看门人”MnOx快速分解以恢复 COF 纳米敏化剂在超声波照射下的活性氧 (ROS) 生成能力。增加的细胞内 ROS 应激和 GSH 消耗伴随诱导铁死亡以提高声动力学功效。此外，非常规的碗形形态使纳米增敏剂具有增强的肿瘤积累和保留。肿瘤特异性声动力疗法与铁死亡相结合，在杀死癌细胞和抑制肿瘤生长方面取得了高效。该研究为开发用于生物医学的具有非常规形貌的 COF 纳米增敏剂铺平了道路，为实现可激活和铁死亡增强的声动力学肿瘤治疗提供了范例。
结果与讨论
功能化碳纳米碗的合成与表征
为了制备COF纳米碗，采用典型的双配体策略，以1,3,5‐三(4‐氨基苯基)苯(TAPB)和2,5‐二甲氧基对苯二甲酸(DMTP)为单体，SiO2纳米球为模板制备了核壳结构的COF。COF层厚度的可调使得COF的形状可以被控制。当COF层较厚时，蚀刻致密的SiO2芯后得到常规的空心结构。相比之下，具有红细胞样形态的COF纳米碗可以用更薄的外壳制造。透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜图像显示，合成的COF纳米碗具有均匀的形貌，平均粒径为≈149 nm。MnO x通过氧化还原反应覆盖在COF纳米碗表面。所得的COF‐MnO x与纯COF纳米碗具有几乎相同的尺寸和碗状形貌，并观察到高度分散的纳米结构。为了验证MnO x的成功生长，进行了能量色散x射线元素映射，以检测COF‐MnO x中的化学元素。这些结果证实了COF‐MnO x中存在所有预期的元素，包括C、N、O和Mn。此外，X射线衍射图显示了高结晶度的COF纳米碗的周期性晶体框架。COF纳米碗和COF‐MnO x上分别出现了2.72°、4.81°、5.63°、7.39°和9.65°的强衍射峰，分别对应于TAPB‐DMTP‐COF的(100)、(110)、(200)、(210)和(220)面。这可能是因为聚多巴胺介导的原位反应可以保护COF纳米碗的晶体框架免受强氧化剂KMnO4的破坏。因此，通过精确控制壳体厚度和原位氧化还原反应，可以制备出具有高结晶度的非常规碗形COF纳米碗。
用X射线光电子能谱研究了Mn的价态。高分辨率X射线光电子能谱表明，在COF‐MnO X中Mn3+和Mn4+共存，这与之前报道的锰氧化物一致。形成的MnO x有望在阻断纳米敏化剂的声动力学活性和纳米酶的催化作用方面发挥双重作用。为了实现生物应用，将PEG修饰到COF‐MnO x表面以提高其生理稳定性。动态光散射测量显示，在聚乙二醇化的COF‐MnO x制备过程中，COF纳米碗的尺寸分布发生了轻微的变化。此外，聚乙二醇化的COF - MnO x在去离子水、磷酸盐缓冲盐水或细胞培养基中1、3、5和7天的平均尺寸没有明显变化。zeta电位的结果也表明聚乙二醇化的COF‐MnO x表面带有轻微的负电荷。聚乙二醇化的COF‐MnO x具有良好的胶体稳定性，有助于其在生物环境中的应用。
谷胱甘肽触发的可活化纳米增敏剂的声动力过程
合成的COF‐MnO x纳米碗结合了COFs高度结晶化的多孔结构和MnO x对肿瘤微环境的响应性，这促使作者探索COF‐MnO x作为响应性纳米载体实现可激活SDT的潜力。选择RB作为模型声敏剂，并将其封装到COF框架中。RB加载量高达20.6%，这可能与COFs丰富的π共轭结构有关。RB在506 nm处的特征吸光度峰在RB@COF处保持稳定，但在表面原位生长MnO x后消失。预计MnO x的猝灭作用可以有效地灭活RB在肿瘤特异性SDT中的光敏性。在以前的研究中也证实了类似的机制。由于其广泛的吸收，外部MnOx可以将负载的光敏剂与光照隔离，从而抑制光触发ROS的产生。光敏剂可通过MnOx层的分解和与O2的接触而被激活，从而恢复光敏性。此外，基于GSH与MnOx之间的特异性反应，之前已经开发了多种响应性纳米平台。然而，MnO x对声敏化过程的“阻断效应”尚未被探索。重要的是要检查MnO x是否可以阻止美国的照射来激活小分子声敏剂。因此，作者推测外部的MnO x会使RCMP成为一种可激活的声敏剂，使被包裹的RB暴露在癌细胞中高浓度GSH(≈10 mm)下，导致SDT的激活。
接下来，研究了GSH触发的RCMP声动力效应。GSH被用作肿瘤特异性诱导剂来研究RCMP的可转化性。具体来说，RCMP与谷胱甘肽孵育不同时间，并使用探针5,5 ' -二硫代比斯-(2 -硝基苯甲酸)(DTNB)检测谷胱甘肽含量。DTNB的特征吸光度随着反应时间的增加而降低，表明GSH可以被RCMP耗尽。这可能是由于RCMP表面的MnO x可以与GSH反应，导致MnO x分解，GSH还原为GSSG。RCMP的能量色散X射线元素映射表明，在与10 mm GSH反应后，表面MnO X被完全消耗，这与电感耦合等离子体光学发射光谱(ICP - OES)检测到的浓度相对应。由于MnO x与GSH之间具有特异性的氧化还原反应，因此MnOx层的分解可以确保肿瘤细胞内的治疗效果可控，从而避免副作用。此外，利用1,3‐二苯基异苯并呋喃(DPBF)作为单线态氧(1O2)探针，研究了RCMP在GSH不存在或不存在的情况下的声动力活性。值得注意的是，在US照射下，RCMP组在410 nm处的吸光度变化可以忽略不计，这与对照组(DPBF+US)相同。与之形成鲜明对比的是，当RCMP经GSH预处理后，DPBF的特征吸收随着US暴露时间的增加而显著降低。定量分析还表明，在GSH存在下，RCMP具有显著增强的声动力效率。这些结果证实谷胱甘肽能有效地恢复被抑制的RCMP声动力效率。
为了进一步阐明可激活的声动力学行为，采用电子自旋共振谱来确定1O2的产生。类似地，在相同的US暴露时间下，活化的纳米敏化剂(RCMP+GSH)比禁用组(RCMP)显示出更强的1O2信号(强度比为1:1:1)，表明GSH触发的声动力效能。值得注意的是，RCMP在高浓度GSH下可以更有效地激活。总的来说，这些发现表明RCMP可以作为一种可激活的纳米敏化剂，能够在GSH激活下从“关闭”状态切换到“打开”状态，发挥声动力治疗功能。由于GSH是细胞内最丰富的还原性物质之一，RCMP的GSH耗损能力可能会进一步提高其治疗效果。MnOx模拟过氧化氢酶的能力已被广泛证实;同样，RCMP能够催化H2O2生成O2以提高局部氧浓度，有利于SDT氧依赖性ROS的生成。综上所述，上述结果表明RCMP不仅可以实现肿瘤特异性激活SDT以最大限度地减少不良副作用，而且还可以结合纳米酶的优点，通过破坏癌细胞细胞内氧化还原稳态来大大提高SDT效率。
可活化纳米敏化剂在体外激活SDT
RCMP增强的ROS生成效率和GSH消耗能力保证了其对癌细胞的治疗效果。从逻辑上讲，在US照射下，RCMP可以有效地启动癌细胞凋亡，这是程序性细胞死亡的主要机制。此外，GSH耗竭通过抑制GPX4参与细胞铁死亡。因此，作者进行了一系列体外细胞实验，以探索可激活的纳米增敏剂用于体外铁凋亡增强SDT的可行性。
首先，使用细胞计数试剂盒- 8 (CCK - 8)测定RCMP的细胞杀伤能力。共孵育24小时后，RCMP对人骨肉瘤细胞(MG - 63)显示出显著的剂量依赖性杀伤作用，但对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒性可以忽略不计。肿瘤特异性细胞毒性可能是由于癌细胞中的内源性GSH水平高于正常细胞。以MG - 63细胞为研究对象，进一步评价其协同治疗效果，并将其分为5组:对照组、US组、RCMP组、RCP常规SDT组(RCP为负载RB的COF纳米碗，未生长MnOx层)加US照射、GSH激活的RCMP SDT组加US照射。与其他组相比，GSH激活的SDT组对MG - 63细胞的毒性程度最高。在相同的US照射条件下，RCMP的细胞杀伤作用明显强于无MnOx的RCP组。这可能是由于如上所述，RCMP的谷胱甘肽耗竭和氧气释放能力实现了可激活的SDT，从而提高了治疗效果。活死染色图像也显示，其他组的活癌细胞比RCMP+US组多，表明RCMP的治疗效果优于其他药物。随后，流式细胞术定量观察MG‐63细胞的凋亡情况。单独US照射可导致难以察觉的细胞凋亡，RCMP -和RCP -处理的细胞凋亡率分别为21.1%和12.7%。相比之下，RCMP治疗后的US照射显著增强MG‐63细胞凋亡(≈66.1%)。这种趋势与上述结果一致， 这表明具有改进声动力功效的纳米增敏剂可以实现良好的细胞杀伤效果。
通过荧光染色观察RCMP增强的声动力效应。使用2,7‐二氯双氢荧光素(DCFH‐DA)探针检测MG‐63细胞内ROS生成水平。用培养基处理的MG‐63细胞作为阴性对照。氧化DCFH的绿色荧光在US处理组和对照组中较弱。在RCMP和RCP+US组均观察到亮绿色荧光，提示ROS水平升高。RCMP+US组的荧光明显高于前两组，这与流式细胞术的结果一致。此外，JC - 1检测试剂盒用于测量MG - 63细胞线粒体膜电位的变化，因为细胞中ROS的大量积累导致线粒体膜去极化和随后的凋亡。探针发出绿色和红色荧光，分别显示低电位的受损线粒体和高电位的正常线粒体。同样，常规SDT (RCP+US)或单独RCMP治疗仅引起细胞线粒体膜电位的中度损失，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像中绿色/红色荧光的增加证明了这一点。然而，在RCMP+US处理的细胞中观察到大部分红色JC - 1聚集物，这意味着GSH激活的SDT诱导了线粒体功能障碍。
激活和铁死亡的机制—增强SDT
考虑到GSH在细胞内ROS解毒中起重要作用，为了探究GSH激活SDT的详细机制，作者进一步研究了RCMP的GSH消耗能力。采用巯基跟踪器紫染色法检测不同处理下细胞内GSH水平。单独用RCMP处理的细胞比对照组和US组表现出更弱的绿色荧光，表明RCMP具有消耗GSH的能力。RCP+US处理的细胞荧光强度也明显降低，说明常规SDT可以通过增加ROS水平消耗细胞内GSH。值得注意的是，RCMP+US组在这些组中表现出最弱的荧光。该组GSH含量的显著降低是由于可激活SDT同时产生ROS和GSH消耗效应。
由于GSH水平的降低直接损害了癌细胞的抗氧化能力，并进一步导致GPX4的下调，因此活化的SDT有望诱导癌细胞凋亡和铁凋亡。因此，作者接下来以甘油醛- 3 -磷酸脱氢酶为内对照，采用western blotting方法研究了GPX4在不同处理MG-63细胞中的表达。RCMP+US组的GPX4条带比其他组弱得多，表明RCMP介导的可激活声动力过程有效地诱导了MG‐63细胞中GPX4的下调。这一结果与RCMP激活的肿瘤特异性SDT可以通过双边增强ROS生成和GSH消耗来灭活MG - 63细胞中的GPX4的假设一致。此外，GPX4是对抗LPO和维持膜脂双分子层稳态的重要因子。GPX4失活和GSH耗竭可能导致细胞内LPO蓄积，LPO是铁死亡的重要生物标志物。BODIPY581/591‐C11是一种LPO敏感探针，用于检测MG‐63细胞在不同处理后的LPO水平。探针显示出非氧化(595 nm)和氧化(520 nm)形式之间的光谱分离。RCMP+US处理的细胞绿色荧光最强，红色荧光最弱，说明RCMP在US照射下可以产生大量LPO，导致铁死亡。为了研究铁下垂引起的特定形态学变化，使用生物透射电镜观察可活化SDT的MG‐63细胞。与正常细胞相比，实验样品的细胞膜崩解，有泡沫化现象，细胞核形态正常，但染色质没有凝聚。RCMP+US处理的细胞线粒体总数也减少，线粒体脊断裂、溶解、消失，线粒体膜密度增加。这些微观形态学变化符合铁死亡的特征。因此，在超声辐照下，RCMP导致癌细胞铁死亡，协同提高声动力治疗效果。
转录组学分析被用于进一步研究铁死亡增强SDT的潜在机制。收集经磷酸盐缓冲盐水(或RCMP+US)处理的MG‐63细胞并进行RNA测序。主成分分析显示，对照组和RCMP+US组基因表达存在显著差异，热图分析结果也证实了这一点。如Venn图所示，两组样品共表达了13063个基因，而仅RCMP+US照射组共表达了877个基因。火山图显示差异表达基因(fold change [FC]≥2.0 [or - 2.0]， p < 0.05)。基因表达的显著差异表明，RCMP在US照射下对MG‐63细胞的分子生物学机制有不同的影响。为了确定RCMP诱导的铁死亡和SDT的相关途径，作者进行了京都基因和基因组百科全书分析，以揭示基因集的富集。多种细胞通路，包括肿瘤坏死因子、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、凋亡和铁凋亡信号通路，在RCMP激活的SDT治疗后显著增强。在这些途径中，MAPK信号通路可以通过细胞内ROS的升高而激活，从而诱导细胞凋亡。此外，肿瘤坏死因子参与caspase‐8介导的凋亡通路，也可诱导细胞凋亡。众所周知的铁死亡相关基因，包括GPX4, SLC7A11, SLC9A14和TFRC，受到明显的调控，提示铁死亡的发生。此外，RCMP+US治疗可显著上调或下调肿瘤细胞中与凋亡密切相关的脂肪酸合酶、肿瘤坏死因子、caspase等凋亡相关基因的表达。总的来说，在US照射下，RCMP可以积极诱导癌细胞凋亡和铁凋亡，保证细胞在可激活的SDT下高效死亡。
RCMP的体内生物安全性
为了评估RCMP的生物相容性和生物安全性，健康雌性ICR小鼠在分娩前7、14和21天静脉注射RCMP (10 mg kg-1)，对照组小鼠注射生理盐水。血液生化检查显示，RCMP对肝肾功能指标的影响可以忽略不计，包括丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、血尿素氮和肌酐，这表明RCMP对正常肝肾功能的长期或短期影响都不显著。血液常规检查发现血液指标在正常参考范围内，说明RCMP血液相容性良好。此外，采集处理小鼠的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行苏木精和伊红(H&E)染色。从组织病理学分析来看，RCMP注射后未见明显的损伤和明显的炎症反应，进一步证明RCMP具有良好的组织相容性。RCMP的高生物安全性允许进一步在体内应用。
铁死亡增强的SDT对骨肉瘤的体内评估
RCMP良好的体外治疗性能和体内生物安全性促使作者使用MNNG‐HOS异种移植物骨肉瘤模型进一步评估其体内抗肿瘤功效。由于碗状COFs尚未在生物医学中得到应用，因此对可活化纳米增敏剂的生物学效应进行了初步研究。鉴于其独特的纳米级形态，利用荧光成像评估了所开发的纳米致敏剂的肿瘤积聚。具体地说，用近红外染料cy5.5标记碗状形态的RCMP和未蚀刻SiO2的球形SiO2@RCMP，并静脉注射到荷瘤小鼠体内。捕获的荧光图像和相应的定量显示RCMP可以有效地在肿瘤部位积累并长时间保留。值得注意的是，与未蚀刻SiO2@RCMP相比，RCMP还具有更高的荧光强度和更长的保留时间，这意味着其具有优越的肿瘤积累效率。正如先前报道的那样，调整纳米颗粒的弹性有可能提高它们对肿瘤的输送效率。据推测，RCMP独特的碗状形状降低了刚度，有助于改善肿瘤的积累和保留。此外，观察到RCMP的细胞内化性能优于球形SiO2@RCMP，具有更高的刚度，这进一步验证了碗形纳米增敏剂的特殊生物效应。可以推断，RCMP的非常规形态和适当的刚度可能有助于其细胞吞噬，这有待于未来的详细研究。虽然潜在的结构-性能关系需要在未来进行深入的研究，但通过调节纳米级COFs的形态来增强纳米-生物相互作用可能为开发具有独特纳米结构和高性能的基于COF的纳米药物提供见解。
鉴于其协同增强的声动力效应和良好的生物学效应，研究了RCMP的治疗效果。当肿瘤体积达到≈50 mm3时，将携带MNNG‐HOS肿瘤的雌性BALB/c裸鼠随机分为生理盐水(对照)、US (1 MHz, 50%占空比，1 W cm−2)、仅RCMP、RCP+US和RCMP+US (10 mg kg−1)组(n = 5)进行不同的处理。根据肿瘤体积曲线，与对照组相比，RCMP和RCP+US组对肿瘤生长的抑制程度中等，而RCMP+US组对肿瘤生长的抑制作用相对较强。此外，在2周的观察期内，在US照射下，RCMP的肿瘤抑制效果优于RB - COF。治疗结束时，对切除的肿瘤进行称重和拍照，结果与小鼠的肿瘤体积呈正相关。根据以上数据，计算肿瘤的生长抑制率。与RCMP(30%)和RCP+US(46%)组相比，RCMP+US组达到了74%的高抑制率，表明RCMP在US照射下具有优越的抗肿瘤功效。连续监测期间各组小鼠波动正常，各组小鼠主要脏器H&E染色均未见治疗结束时组织损伤。结果表明，所有治疗均具有生物相容性和良好的耐受性。
H&E染色分析各组治疗效果;使用TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)、Ki - 67和GPX4进行免疫组织化学染色;DCFH‐DA和缺氧诱导因子(HIF)‐1α免疫荧光染色。H&E染色显示RCMP+US组肿瘤组织腔体粗大，胞浆大量溢出，提示肿瘤细胞凋亡或坏死。RCMP+US治疗导致大量细胞凋亡(TUNEL阳性百分比升高)。此外，Ki‐67的免疫组化阳性率在RCMP+US组中最低，进一步证实了其对肿瘤细胞增殖的显著抑制作用。值得注意的是，GPX4在RCMP+US组的肿瘤组织中表达显著降低，表明RCMP的良好抗肿瘤效果可归因于铁死亡增强的SDT。此外，在RCMP和RCMP+US组中，HIF‐1α的表达降低表明，MnO x的过氧化氢酶模拟能力可以在一定程度上改善肿瘤的缺氧。因此，DCFH‐DA染色结果表明RCMP+US组的ROS生成强于RCP +US组。因此，体内实验结果证实，所开发的可活化纳米增敏剂RCMP可以通过协同增强和增强SDT，在US照射下获得较高的抗肿瘤疗效。
结论
总之，作者成功地合成了一种基于COF纳米碗的纳米敏化剂，它具有独特的纳米级形态和可激活的声动力活性。COF纳米碗具有高结晶度和丰富的孔隙度，可以有效地装载小分子声敏剂RB。通过设计负载RB的COF纳米碗和MnO x壳来获得可激活的纳米敏化剂。受益于GSH响应降解行为，MnO x充当可拆卸的“看门人”，以阻断RCMP的声动力效应。肿瘤特异性纳米增敏剂在US照射下从“关闭”状态切换到“打开”状态，在肿瘤部位发挥治疗效果，使GSH激活的声动力过程同时诱导GPX4的下调。体外实验表明，RCMP联合US照射可破坏细胞内氧化还原止血并引起癌细胞铁死亡。这些协同作用增强了治疗效果。体内评价也证实了碗状的形态使得COF纳米增敏剂对肿瘤的积累和保留有特殊的增强作用。因此，RCMP在US照射下表现出抑制肿瘤生长的高效能。总之，本研究为基于COF的非常规形态纳米敏化剂的可控合成和发展铺平了道路，为实现可激活和增强铁死亡的SDT提供了新的策略，并扩展了纳米级COFs的生物医学应用。
参考文献
Covalent Organic Framework Nanobowls as Activatable Nanosensitizers for Tumor-Specific and Ferroptosis-Augmented Sonodynamic Therapy. Shanshan Zhang, Shujun Xia, Liang Chen,* Yu Chen,* and Jianqiao Zhou*. Adv. Sci. 2023, 10, 2206009. https://doi.org/10.1002/advs.202206009
