内容提要
本文合成了三种金属4-甲基苯基卟啉（TTP）配合物（MnTTP、ZnTTP和TiOTTP），并将其与人血清白蛋白（HSA）包封在一起，形成新型的纳米声敏剂。这些纳米材料在US照射下产生丰富的单线态氧（1O2），重要的是显示出优异的US激活能力与深组织深度高达11厘米。与ZnTTP-HSA和TiOTTP-HSA相比，MnTTP-HSA表现出最强的ROS活化行为，这是由于密度泛函理论的最低最高占据分子轨道-最低未占据分子轨道间隙能。它也是有效的深部组织光声/磁共振双模成像跟踪肿瘤中的纳米颗粒的积累。此外，MnTTP-HSA有趣地实现了高SDT效率，用于同时抑制小鼠中远离超声源的双侧肿瘤的生长。
实验结果与讨论
MTTPs及其与HSA纳米复合物的制备与表征
为了合成三种金属卟啉络合物，使用不同溶剂和反应时间的通用回流方法。对于MnTTP，在二甲基甲酰胺（DMF）中，Mn离子被配位到TTP的N原子上超过5小时。DMF是一种弱碱性溶剂，有助于除去氮原子上的质子。ZnTTP在四氢呋喃（THF）中在2.5小时后获得，仅为MnTTP所需时间的一半。对于TiOTTP，使用具有一定量吡啶的DMF，并且反应进行24小时以提高产率。此外，对于ZnTTP，反应温度控制在55-60°C，对于MnTTP和TiOTTP，反应温度控制在155-165°C。三种配合物的合成表明，即使是相同的配体，反应时间，以及适当的溶剂选择是重要的不同的金属离子的配位。测量1H-NMR和电喷雾电离质谱光谱，以测定配位络合物。此外，通过Gaussian 98软件包在B3 LYP/6- 31 G（d）水平上对这些配合物的结构进行了模拟和优化，显示Mn（II）离子和Zn（II）离子是平面的，而Ti（IV）离子是与四个氮原子和一个氧原子配位的四角锥。获取含有游离配体TTP的DMF溶液的样品的紫外-可见光谱。光谱表现出卟啉的典型特征，包括在420-460 nm范围内的Soret带和在500-650 nm处的相应弱Q带。与自由配体光谱相比，金属配合物的光谱在两个方面有所不同。首先，在Soret带的峰位置观察到TiOTTP和ZnTTP的中等红移（8 nm）和MnTTP的强红移（40 nm）。第二，配合物的Q带中的第一和第四带减弱或几乎消失，这可能是由于金属离子的配位增加了卟啉的大环对称性，使四个Q带合并为两个。此外，配位后，这些电子跃迁产生的激发态可能会从配体-配体电荷转移（LLCT）态转变为配体-金属电荷转移（LMCT）态，这是红移的主要原因。金属配合物通过超分子相互作用或共价修饰与蛋白质结合是生物科学中的一个重要研究方向。由于这些MTTP复合物不是水溶性的，HSA蛋白包封是溶解它们、降低它们的毒性、延长这些药物在血浆中的储存/循环时间并提高它们的最大效力的良好策略。为了获得这些MTTP-HSA纳米颗粒，首先使用氯仿（CHCl3）溶解MTTP。然后，通过在冰浴下超声处理，将它们分别与HSA溶液混合。在制备纳米粒的过程中，需要控制MTTP和HSA的质量比。这些MTTP-HSA纳米复合物也在水中通过紫外-可见光谱进行了表征。纳米复合物的UV-vis吸收光谱具有与MTTP复合物几乎相同的形状，并且通过UV-vis光谱检测到的包封效率为96.4±3.2%。此外，测试了MTTP-HSAs在胎牛血清（FBS）中的分散稳定性，MTTP-HSAs的流体动力学尺寸没有显著增加，表明其具有良好的分散稳定性。此外，还评价了金属卟啉的释放曲线。这些纳米复合物在24h时释放了约40%的金属卟啉，在72h时总释放超过60%。此外，在水中的荧光（FL）光谱进行了研究。这些纳米复合物的最大发射波长为400 nm（λex = 360 nm）。进行DLS测量以评估这些纳米复合物的尺寸，证实它们具有相似的尺寸分布，平均直径为1.60 nm，其适合于通过增强的渗透性和保留（EPR）效应被动靶向肿瘤组织并逃避网状内皮系统的清除。TEM图像表明，三种纳米复合物都是典型的球形。这些特征的结果是显着重要的探索的SDT效应的纳米复合物，金属中心变成了主要的差异之间的纳米复合物。
超声波辐照下纳米复合物的1O2生成和深度穿透响应
为了研究SDT效率，首先使用单线态氧传感器绿色（SOSG）在溶液中评估这些纳米复合物的1O2生成。在US照射下，这些纳米复合物均产生1O2，与未接受US照射的纳米复合物相比，强度随时间增加。结果表明，这些纳米复合物可以作为潜在的SDT声敏剂。此外，MnTTPHSA表现出更好的性能比其他两个，这表明金属中心，作为唯一的差异，可能会影响光照效果。此外，这些纳米复合物在超声处理前后仍然稳定，溶液状态和尺寸分布无明显变化。随后，测量了每种纳米复合物溶液的ESR谱，以探索溶液中SDT的机理。2，2，6，6-四甲基哌啶（TEMP）和5，5-二甲基1-吡咯啉-N-氧化物（DMPO）在US暴露下用于抑制1O2和自由基。从结果，在这些纳米复合物中均清楚地观察到特征性1O2诱导的信号（三条窄线），证明了在声动力辐照期间单线态氧的快速产生。在此，MnTTP-HSA在相同的测试条件下也表现出更高的信号。与来自单线态氧的信号相反，来自三种复合物的自由基信号（四条窄线）在US照射后非常弱，表明没有产生显著的自由基产率。为了研究这些纳米复合物在US辐照下的US可活化深度，在长度为11 cm的组织模拟模型中监测单线态氧的产生。当这些纳米复合物暴露于US（1 MHz，2 W cm-2，50%占空比）5分钟时，通过离体/体内成像系统测试1O2的FL信号。所有三种纳米复合物甚至在距离US探头高达11 cm处产生1O2，这对于通过腹侧背部治疗人类中的深位肿瘤是相当重要的。此外，还定量分析了生成的1O2的FL强度。MnTTP-HSA在超声辐照下的良好响应表明该纳米复合物可以在体内被深度超声激活。为了检测裸鼠MCF-7肿瘤中的1O2生成，将US探针放置在小鼠远离肿瘤的一侧，距离肿瘤至US探针约3.5 cm。在US照射5分钟后，通过离体/体内成像系统观察到ROS产生的信号，表明MnTTP-HSA通过US穿透小鼠全身而在体内活化。因此，该复合物可作为一种良好的深部组织SDT声敏剂，对人类和大动物的深部组织治疗具有重要意义。卟啉及其金属配合物作为能够产生1O2单线态分子氧的高效三重态光敏剂是公知的。与光能一样，US激发能可能产生金属卟啉三重激发态（3 MTTP *），其进而被周围的分子氧有效拦截，得到给予1O2，成功用于SDT。此外，单线态氧产生的效率可以通过在核心处适当地配位金属离子来调节。为了更好地理解1O2生成的差异，采用密度泛函理论在B3 LYP/6- 31 G（d）水平上对HSA纳米颗粒中的三种复合物进行了计算。MnTTP的最高占据分子轨道（HOMO）主要由Mn离子的dxy原子轨道（AO）组成，LUMO强烈地定域在Mn离子上（dx 2 AO）。而TiOTTP/ZnTTP的HOMO/LUMO主要是在卟啉上C和N原子的pAO上离域。此外，TiOTTP和ZnTTP的能隙分别为2.820和2.912 eV，而MnTTP的能隙仅为0.537 eV，明显低于TiOTTP/ZnTTP。这些结果表明，MnTTP在能量下容易被激发，这可能与在相同的辐照条件下，MnTTP产生1O2的能力较强有关。
在US照射下MTTP-HSA的体外SDT功效溶液中金属纳米复合物的ROS产生需要通过诱导癌细胞死亡来评估体外SDT效率
通过细胞计数试剂盒-8（CCK 8）测定法测定了这些纳米复合物在不存在US处理的情况下对MCF-7细胞的生物安全性。当MTTP-HSA浓度低于5.5 × 10 - 6 M时，它们对受试细胞均无明显毒性。然后，在US照射（1.0 MHz，2 W cm-2，50%占空比，3 min）后测定体外毒性。TiOTTP-HSA + US组和ZnTTP-HSA + US组中分别有26%和35%的细胞死亡，而MnTTPHSA + US处理的细胞死亡超过80%，显示出最佳的SDT效果。活/死细胞的FL染色随后证明了MnTTP-HSA的优异SDT功效。使用共聚焦显微镜同时测定这些纳米复合物的细胞内ROS水平。MnTTP-HSA与US照射（1.0 MHz，2 W cm-2，50%占空比，3 min）诱导更多的ROS，如癌细胞中强绿色FL所示。通过在多扫描光谱仪中测量FL强度来进行ROS生成的定量分析，并且结果与共聚焦显微镜的结果一致。结合溶液中1O2的检测和ESR实验，这些结果表明，这些纳米声致敏剂在超声照射下产生1O2，以实现SDT治疗功能。MnTTP的HOMO-LUMO的低能隙（0.537 eV）将非常有助于1O2的产生，因为它在US照射下显示出最佳的效率。
MnTTP-HSA的MRI/PA双模态成像体外和体内潜在的诊断成像指导对于实时监测体内组装的声敏剂的有效SDT具有实际意义。
Mn离子及其配合物已被开发为T1-MR成像对比剂。在此，MnTTP-HSA显示出T1-MR成像的适用性，在溶液中的弛豫率r1为1.105 mm−1s−1。为了评价体内MR成像，给荷MCF-7肿瘤的裸鼠静脉注射MnTTP-HSA。随着时间的推移，肿瘤处的T1阳性信号在3小时内显示出增加的趋势，然后逐渐降低。半定量T1信号强度在注射后3 h达到峰值。得益于卟啉及其衍生物的PA性质，MnTTP-HSA也有望用PA方法成像。首先，在溶液中测量MnTTP-HSA的体外PA图像和信号强度。PA信号强度与MnTTP-HSA浓度之间存在良好的线性关系。通过静脉注射MnTTP-HSA对荷MCF-7肿瘤的裸鼠进行体内PA成像。肿瘤处的最高PA信号出现在约3小时，这与MR成像中出现最大信号时相似。半定量PA信号强度测量同时显示在前24小时内的强度变化。值得注意的是，肿瘤的无序和渗漏的血管结构引起颗粒的渗透性和保留增强（EPR效应），导致更好地靶向肿瘤和它们在其中的改善的积累。MnTTP-HSA纳米粒的双模态MR/PA成像功能可真实的监测肿瘤内药物的蓄积，为临床提供治疗时间和剂量，有效实现SDT的实时诊断和治疗。
MnTTP-HSA对肿瘤的体内SDT效率MnTTP-HSA的高体外SDT效率
建立了两侧具有两个肿瘤的MCF-7荷瘤异种移植物，用于评估MnTTP-HSA通过SDT处理的体内治疗功效。从右侧向左侧进行US辐照。两种肿瘤在没有US辐射的情况下快速生长。单独的US治疗在限制肿瘤生长方面没有效果。相比之下，MnTTP-HSA + US组在完全抑制肿瘤生长方面表现得最好，并且重要的是，US可激活的SDT从右侧肿瘤到左侧肿瘤穿透整个小鼠身体，显示出肿瘤完全抑制的高效治疗。通过比较切除的肿瘤重量进一步证实了结果。MnTTPHSA + US照射组肿瘤生长明显受抑，肿瘤重量与其他组比较有显著性差异。SDT治疗结束时各种治疗小鼠和切除肿瘤体积的照片均显示MnTTP-HSA + US组中的小鼠已被最好地治愈。以上结果表明，MnTTP-HSA在超声照射下可穿透小鼠全身的深部组织治疗肿瘤。此外，在SDT期间，所有处理组中的小鼠体重没有明显变化，并且MnTTP-HSA+US组的小鼠实现了100%存活，这表明实验处理具有良好的耐受性，并且还表明MnTTP-HSA纳米复合物具有良好的生物安全性和生物相容性。此外，通过测定静脉注射后3、12和24 h主要器官随时间推移的Mn含量，分析了MnTTP-HSA的生物分布。结果表明，MnTTP-HSA纳米复合物在3 h时在肝、脾和肿瘤组织中均有蓄积，而在24 h时主要在肿瘤组织中蓄积，说明MnTTP-HSA具有良好的靶向性，肿瘤滞留能力增强，生物安全性好。
结论
本演剧合成了Mn（II）、Zn（II）、Ti（IV）三种金属卟啉配合物，并将其与HSA包埋，制备了纳米复合物。首次通过US深部组织激活和MR/PA成像能力系统地探索了一系列新型金属卟啉络合物纳米颗粒用于无创精确SDT治疗。MTTP-HSA纳米复合物在高达11 cm的深层组织中显示出优异的1O2活化，这对于深层肿瘤SDT非常重要。它们都被证明可以产生单线态氧来抑制细胞增殖，而MnTTP-HSA由于密度泛函理论的结构模拟具有最低的HOMO-LUMO能隙，因此呈现出最佳的US可激活SDT性能。MnTTP-HSA产生大量的1O2，在体内不仅有效地抑制邻近肿瘤的生长，而且有效地抑制远离超声探头的远处肿瘤的生长，实现不同深度的SDT。
参考文献
Metalloporphyrin Complex-Based Nanosonosensitizers for Deep-Tissue Tumor Theranostics by Noninvasive Sonodynamic Therapy. Aiqing Ma, Huaqing Chen, Yanhong Cui, Zhenyu Luo, Ruijing Liang, Zhihao Wu, Ze Chen, Ting Yin, Jun Ni, Mingbin Zheng,* and Lintao Cai*. Small 2019, 15, 1804028. https://doi.org/10.1002/smll.201804028.
