内容提要
我们报道了一种由醛脱氢酶可活化光敏剂和二硫化物连接的全反式维甲酸组成的自组装纳米前药，用于癌症干细胞富集肿瘤的诊断和靶向治疗。二硫化物连接的全反式维甲酸可以负载光敏剂并自组装成稳定的纳米前药，通过高水平的谷胱甘肽可在癌症干细胞中拆卸成全反式维甲酸和光敏剂。对于释放的光敏剂，在癌症干细胞富集的微环境下，过表达的醛脱氢酶催化醛类氧化为羧基，激活活性氧的生成和荧光发射。这种活性氧的产生导致了对癌症干细胞的直接杀伤，并伴随着明显的荧光增强，用于实时监测癌症干细胞富集的微环境。而且，释放的全反式维甲酸作为分化剂，降低了癌症干细胞的干性，改善了癌症干细胞富集的微环境。
PS-CHO的合成、ALDH反应以及ROS生成
PS-CHO和ATRA-SS-ATRA的合成路线如图所示。ALDH是一种在体内负责将醛氧化为羧酸的酶。首先采用ESI-MS定性分析评估PS-CHO的aldh反应性。与ALDH孵育后，在817.13 [M +H+]处出现了一个新的离子峰，该离子峰归属于PS-COOH。此外，还采用高效液相色谱法(HPLC)对aldh反应性进行了定性分析。如图所示，PS-CHO的滞留时间为5.06 min，与ALDH孵育后，PS-CHO的强度降低，而PS-COOH的滞留时间为2.78 min。此外，还采用HPLC法对高ALDH水平下的PS-CHO进行了定量分析。在PBS溶液中孵育4 h后，PS-COOH的累积百分比达到50.7%(10%的DMSO，由于PS-CHO在PBS溶液中的溶解度较差)，这种相对中等的转化率可能是PS-CHO的水溶性较差造成的。这些结果表明，在生理条件下，ALDH可以有效地将PS-CHO氧化为PS-COOH。接下来，我们研究了有或没有ALDH的PS-CHO的荧光特性。如图所示，在550 nm激发时，PS-CHO在778 nm处显示出较弱的荧光信号。ALDH孵育后，在767 nm处观察到明显的荧光增强，随时间逐渐增强，并在4 h达到平台期。较高的ALDH浓度也在767 nm处触发较高的荧光强度，属于PS-COOH。此外，我们还在体外评估了ALDH对PS-CHO的特异性。只有ALDH可以诱导pH - cho的显著荧光增强，并且在pH 4至10范围内信号稳定。受PS-CHO在生理条件下良好的ALDH响应行为的启发，我们接下来使用ROS探针(二氯二氢荧光素，DCFH)评估了高ALDH微环境下ROS的产生。与游离PS-CHO孵育的DCFH溶液在525 nm光照射下没有明显的荧光增强，表明其ROS生成能力较差。然而，ALDH孵育后，PS-CHO荧光明显增强，表明反应后ROS的产生能力被激活。此外，PS-CHO + ALDH的ROS生成随着照射时间的延长而增加。
缺氧是CSC微环境最重要的自然特征之一，由于传统ii型PSs通过氧依赖性ii型光敏过程产生有毒单线态氧(1O2)，从而抑制其治疗效果。最近，新出现的证据表明，i型PSs为克服传统PDT治疗的这一局限性提供了一种有效和安全的策略。i型PSs是由受激PSs的三重态与周围底物(如脂质和蛋白质)之间的电子转移诱导形成的，导致各种ROS物质的形成，如超氧阴离子(·O2-))，对氧浓度依赖性相对较低。因此，我们研究了活化的PS-CHO (PS-COOH)产生ROS的机制，以确定它是属于i型还是ii型PSs。与ALDH孵育后，PS-CHO中二氢膦丹明123(·O2-)I型PS指示剂)的荧光强度提高了33.1倍，明显超过了PS-CHO和PS-COOH单独孵育后的增强效果。另一方面，在光照下，以9′，10′-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)为II型PS指示剂，PS-CHO与不含ALDH均表现出较低的1O2生成，与PS-COOH较低的1O2生成一致。综上所述，这些结果表明PS-COOH是i型PS。由于PS-CHO是一种疏水分子，水溶性较差，因此采用ATRA-SS-ATRA纳米配方来提高PS-CHO的生物相容性。首先通过动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)对ATRA-SS-ATRA的小分子自组装行为进行了评估。ATRA-SS-ATRA纳米颗粒呈球形，尺寸分布明显良好(平均尺寸为143 nm)，多分散性指数较低(PDI为0.115)。DLS显示纳米颗粒具有轻微的负表面电荷(ζ电位:−0.178 mV)。基于这一发现，采用ATRA-SS-ATRA纳米沉淀法制备了PS-CHO(纳米前药，PS-CHO@ATRA-SS-ATRA)的纳米配方。DLS和TEM结果表明，PS-CHO@ATRA-SS-ATRA的平均粒径为166.4 nm (PDI: 0.129)，具有明显的Tyndall效应，呈球状，且ζ电位为正(8.78 mV)。HPLC法测定PS-CHO@ATRA-SS-ATRA中PS-CHO的载药效率(DLE)约为52.1%。通过DLS对其稳定性进行了研究，在30天后，尺寸分布和PDI保持稳定(。此外，由于ATRA-SS-ATRA中存在- ss -，在10 mM GSH孵卵后PS-CHO@ATRA-SS-ATRA被分解。这种GSH响应性的分解行为也能诱导PS-CHO从纳米颗粒中释放，并通过HPLC研究了PS-CHO的释放行为。随着GSH浓度的增加，PS-CHO@ATRA-SS-ATRA逐渐释放PS-CHO，孵育4小时后达到最大累积释放83.1%。同时也检测到类似的ATRA药物释放率(77.8%)。
细胞内ALDH反应和ROS生成PS-CHO@ATRA-SS-ATRA
我们首先利用荧光技术研究了小分子PS-CHO和纳米前药PS-CHO@ATRA-SS-ATRA的aldh反应行为csc富集的4T1细胞。溶解在1% DMSO中进行细胞实验的小分子PS-CHO由于溶解度较差，没有检测到明显的荧光信号，而纳米前药PS-CHO@ATRA-SS-ATRA中有较强的荧光信号。近年来，有确凿的证据证明，缺氧微环境是csc富集微环境的典型特征，它可以诱导ALDH的高表达，并上调csc富集微环境。基于这些发现，我们评估了缺氧条件下4T1细胞的ALDH响应行为。在缺氧条件下，由于ALDH水平升高，PS-CHO@ATRA-SS-ATRA的荧光强度更强。并且该强度以时间和剂量依赖的方式逐渐增加，提供csc富集微环境的实时报告。作为对照，3T3细胞(正常细胞)在缺氧条件下无明显荧光信号，说明PS-CHO@ATRA-SS-ATRA对正常细胞的副作用较低。基于PS-CHO@ATRA-SS-ATRA在csc富集4T1细胞中良好的ALDH响应激活和高效的药物释放行为，我们接下来以ROS探针(DCFH-DA)为指标研究其ROS生成。在4T1细胞中，ATRA-SS-ATRA、游离PS-CHO和未光照的PS-CHO@ATRA-SS-ATRA中检测到微弱的绿色荧光，光照后的PS-CHO由于细胞摄取不良也表现出较弱的绿色荧光。相比之下，纳米前药PS-CHO@ATRA-SS-ATRA在光照射后在4T1细胞中表现出更强的荧光，这表明高水平的ALDH可以将PS-CHO转化为PS-COOH，从而触发ROS的产生。在正常细胞中，所有配方中仅检测到微弱的荧光，这表明我们的纳米前药不能产生ROS，因此具有良好的生物安全性。为了进一步确认ALDH响应荧光和ROS生成，我们使用N, N-二乙基氨基苯甲醛(DEAB)作为ALDH抑制剂进行对照实验。PS-CHO@ATRA-SS-ATRA孵育后4T1细胞红色荧光较强，DEAB预处理后4T1细胞红色荧光明显减弱。这种下降是由于ALDH的抑制，阻止了PS-CHO转化为PS-COOH的转化。相似的是，在DEAB预处理的4T1细胞中也观察到ROS生成的显著减少)。
细胞内aldh反应性PS-CHO@HA-ATRA-SS-ATRA
我们首先评估了纳米前药的血液相容性。小分子PS-CHO由于水溶性较差，溶血率在20%以上，而含有DSPE-PEG2000-HA的纳米配方溶血率最低(小于2%)，说明小分子PS-CHO的生物相容性较差。随后，利用IVIS成像系统检测体内药物释放，aldh活化的PS-COOH可作为监测药物分布的荧光染料。1h后在肿瘤部位检测到明显的荧光信号静脉注射PS-CHO@HA-ATRA-SS-ATRA，随时间增加，注射12 h后仍保持较强。在主要脏器中，我们在注射前3 h仅在肝脏部位观察到一些荧光信号，而在注射12 h时其他部位未见明显信号。作为阳性对照，PS-COOH也转化为ha修饰的纳米颗粒(PS-COOH@HA-ATRA-SS-ATRA)，显示“永远亮”的荧光信号。在我们发现首先在肝脏中检测到更强的荧光信号，然后逐渐在腹部部位积累。注意，肝脏和腹部-男性部位的荧光信号在全身给药后6小时逐渐升高至最高，然后保持稳定。肿瘤部位在4 h可见明显的荧光信号，6 h荧光信号增强，但荧光信号远低于PS-CHO@HA-ATRA-SS-ATRA。说明PS-CHO@HA-ATRA-SS-ATRA主要在肿瘤部位触发PS-CHO，可能具有良好的生物安全性。注射12 h后处死小鼠获得主要器官进行离体成像，如图所示，PS-CHO@HA-ATRA-SS-ATRA在组织上荧光信号最强，而PS-COOH@HA-ATRA-SS-ATRA主要分布在代谢器官(如肝、肾);这可能会引起潜在的光毒性和其他副作用。这些令人鼓舞的结果说明了PS-CHO@HA-ATRA-SS-ATRA的aldh反应能力的优势，它主要在csc富集的肿瘤上被激活，具有高选择性和良好的生物安全性，显示出良好的治疗效果。
4T1皮下模型的体内抗肿瘤效率
受我们的纳米前药良好的肿瘤积累和有效的aldh反应性的启发，我们进一步研究了它们在肿瘤治疗中的作用。与生理盐水相比，在治疗21天后，全身给予ATRA-SS-ATRA (G3)和PS-CHO@ATRA-SS-ATRA不进行光照(G4)对肿瘤生长的抑制作用可以忽略不计。光照下的小分子PS-CHO (G2)也表现出较差的肿瘤生长抑制作用。而不含ATRA的PS-CHO纳米配方PS-CHO@HA-DSPE-PEG2000，用DSPE-PEG2000-HA修饰PS-CHO (，可以明显抑制肿瘤生长。另一方面，PS-CHO@ATRA-SS-ATRA与光照射(G6)表现出比G5更好的肿瘤生长抑制作用，这与ATRA的协同治疗作用有关。正如预期的那样，csc靶向的纳米前药PS-CHO@HA-ATRA-SS-ATRA (G7)几乎完全缓解了肿瘤的生长，大多数小鼠肿瘤都大大缩小甚至消失。图的总结分析也揭示了G7的最佳抑瘤效果。第21天处死所有小鼠，解剖收集肿瘤组织和主要器官，解剖肿瘤组织的照片和重量也显示G7组对肿瘤生长的抑制效果最好离体肿瘤组织的卫生与电子染色也证实了类似的结果。G7处理后的肿瘤组织有明显的组织学损伤。G7治疗后小鼠体重无明显下降，主要器官无明显组织学损伤，表明该csc靶向纳米前药的安全性。因此，G7处理的小鼠在21天的治疗期间表现出最高的肿瘤生长抑制和更好的生物安全性。
结论
我们已经探索了一种简单和收敛的自组装纳米前药物，其中包含aldh激活的PS和分化剂ATRA，用于csc相关肿瘤的治疗。aldh激活的PS (PS-CHO)在体外表现出良好的aldh响应性，可触发ROS活化并产生荧光。为了提高生物相容性和体内治疗效果，我们将ATRA与- ss键连接形成gsh响应的ATRA-SS-ATRA，其具有良好的小分子自组装行为，可作为装载PS-CHO的良好纳米载体。PS-CHO@ATRA-SS-ATRA不仅因其良好的水分散性而有效增强了PS-CHO的药代动力学，而且还通过ATRA的协同作用降低了CSC的干性，改善了csc富集的肿瘤微环境。在csc富集的肿瘤细胞中，PS-CHO@ATRA-SS-ATRA被高水平GSH分解为PS-CHO和ATRA, PS-CHO在高表达ALDH的情况下转化为PS-COOH，产生荧光，实时报告CSC微环境信息。此外，PS-COOH表现出良好的ROS生成，可以直接消除CSC，间接改善csc富集的微环境。
参考文献
Self-assembled aldehyde dehydrogenase activatable nano-prodrug for cancer stemcell-enriched tumor detection and treatment，Bowen Li, Jianwu Tian, Fu Zhang, Chongzhi Wu, Zhiyao Li,DandanWang,Jiahao Zhuang, Siqin Chen, WentaoSong,YufuTang,YuanPing ,Bin Liu ,Nat. Commun| (2024) 15:9417,https://doi.org/10.1038/s41467-024-53771-8
