内容提要
羟基自由基（·OH）作为最活跃和最具攻击性的活性氧（ROS），在细胞氧化还原调节和铁死亡过程中发挥着重要作用。 开发高选择性、高灵敏度的·OH检测和成像方法是一个巨大的挑战。 通过将3-甲基吡唑啉酮作为特异性识别基团引入由肼基团形成的NIR荧光团AXPI-NH2的半花青骨架上，设计并合成了一种新型近红外（NIR）荧光探针探针-HMP。探针-HMP在体外表现出优异的检测性能。基于·OH启动子醋酸苯汞（PMA）和·OH清除剂4-羟基-TEMPO（Tempol）的作用，探针-HMP成功地获得了HepG2细胞、拟南芥和小鼠内源性·OH的图像。探针-HMP通过使用erastin和甲磺酸去铁胺（DFO）诱导或抑制铁死亡，可以实现HepG2细胞铁死亡过程中内源性·OH的检测，揭示探针-HMP的荧光强度变化是由·OH产生引起的 铁死亡伴随着显着的·OH 产生。
探针-HMP的合成及其对·OH 的光谱响应
通过将特异性识别部分 3-甲基吡唑啉酮引入到半花青主链 AXPI-NH2 作为近红外荧光团，与肼基团形成，设计并合成了一种新的近红外荧光探针 探针-HMP。 该设计基于分子内电荷转移（ICT）机制的思想，其中羰基与3-甲基吡唑啉酮反应成环后直接与氮原子连接，削弱了AXPI-的推拉电子效应 NH2本身，导致荧光强度降低。 当识别基团3-甲基吡唑啉酮与·OH发生特定的单电子氧化反应时，ProbeHMP的推拉电子共轭效应发生改变，导致开环和荧光增强。
探针-HMP与·OH 反应的紫外可见吸收光谱和荧光光谱如图所示。探针-HMP在 620 nm 处显示最大吸收峰，在 670 nm 处显示肩峰。 添加·OH(80 μM)后吸收强度显着增强，最大吸收峰出现在670 nm处。 如图所示，探针-HMP在670 nm激发后在708 nm处表现出较弱的荧光强度，而荧光强度随着·OH浓度（0−100 μM）的增加而增加。 这些光学性质的变化表明探针-HMP在与·OH反应前后表现出不同的吸收和发射行为。这是因为羰基通过特异性识别基团3-甲基吡唑啉酮与·OH发生反应，改变了推拉电子效应，导致荧光强度增强。 为了评价探针-HMP的光稳定性和酸碱稳定性，研究了反应时间和pH值对·OH与探针-HMP反应的影响。探针-HMP对·OH表现出瞬时荧光反应，并且荧光强度在1800秒内基本保持恒定。探针-HMP同时没有表现出明显的荧光变化，表明该探针具有优异的光稳定性。pH从6变为9对探针-HMP与·OH的反应几乎没有荧光影响，表明探针-HMP在不同pH值下都是稳定的。 结果表明，探针-HMP具有优异的化学稳定性，能够对·OH 瞬时稳定响应，适合生理条件下·OH 的实时检测。评价探针-HMP与不同浓度的·OH 反应的灵敏度。 ·OH，在优化条件下，得到探针-HMP的荧光强度与·OH浓度的线性相关性，如图所示。 在·OH浓度范围0−50 μM范围内，线性回归方程为F = 202.96 + 8.30 [·OH] (μM)，相关系数为0.993。 通过3s/S模型计算检测限为24nM。
为了评估 Probe-HMP 对·OH 的选择性，设计了实验来研究其对金属离子（MgCl2、CaCl2、FeCl2、FeCl3、CuCl2 和 ZnSO4）、氨基酸（Glu、Lys 和 Cys）、还原性物质的响应 (GSH)、ROS（H2O2、1O2、ClO− 和 ONOO−）、氧化剂四氯苯醌 (TCBQ) 和 叔丁基氢过氧化物 (TBHP) 和活性氮物质（NO 和 NO2 -），可能会干扰检测过程。 结果表明，Probe-HMP仅对·OH有响应，其他相关生物物质的干扰可以忽略不计。 因此，即使在复杂的生物样品和系统中，Probe-HMP 也具有高选择性检测·OH。
HepG2 细胞中·OH 的荧光成像
将其应用于活体HepG2细胞内·OH的激光共聚焦成像。PMA是公认的·OH启动子，因此将PMA与细胞孵育以刺激细胞·OH应激。图中显示了与PMA(1μg·mLHMP 1)孵育0、20、40和60分钟，然后探针-−(20μM)处理30分钟后获得的HepG2细胞的荧光成像。在PMA诱导下，随着时间的延长，细胞的荧光信号逐渐增强，细胞的荧光强度在60min时达到最大。为了证明荧光强度的增加对探针-HMP对·OH的特异性反应，设计了抑制实验。用·OH清除剂Tempol孵育30分钟后，可观察到细胞的荧光强度显著降低。结果表明，Tempoll能有效清除PMA产生的·OH，提示细胞荧光变化是由于探针-HMP与·OH的特异性反应引起的。同时测量HepG2细胞图像的相对荧光像素强度，如图所示。PMA作用60min和Probe-HMP作用30min的HepG2细胞的荧光强度定义为1.0，PMA处理0、20和40min后再与Probe-HMP孵育30min的细胞的荧光强度分别为9.1%、35.4%和74.3%。经PMA诱导60min，再用Tempol30min和Probe-HMP处理30min后，细胞的荧光强度约为53.8%。为了评价HMP探针与·OH的靶向性，将A549细胞与具有良好成像效果的HMP探针和CDHQ(λex=561)共孵育。细胞用启动子PMA(1μg·mLPMA 1)处理40和60min，然后与探针HMP(20μM)和CDHQ(20μM)共孵育30min。如图所示，探针-HMP和探针CDHQ在A549细胞中都显示出与·OH定位的强荧光信号，并且探针-HMP和探针CDHQ的荧光图像融合得很好，证实了探针-HMP可以特异性靶向。
基于荧光成像的优异性能，我们进一步应用Probe-HMP监测HepG2细胞铁死亡过程中·OH的行为。 如图所示，用erastin (10 μM)处理不同时间诱导铁死亡，然后与Probe-HMP孵育30分钟(b−d)的细胞的荧光强度显着高于用Probe-HMP孵育的细胞。 仅 HMP (a)，荧光强度随着与erastin 孵育时间的增加而增强。 将erastin诱导6 h后与Probe-HMP孵育30 min的细胞荧光强度定义为1.0； 经erastin诱导0、2和4小时，然后用Probe-HMP处理30分钟的细胞的荧光强度约为14.30%、35.06% 和 60.56%。如图所示，HepG2细胞的荧光强度被铁死亡抑制剂DFO有效降低，经计算约为42.36%。 这些结果证明Probe-HMP的荧光强度变化是由HepG2细胞在铁死亡过程中产生的·OH引起的，这表明Probe-HMP可以成为探索铁死亡相关生理和病理过程的有力工具。
·OH 体内荧光成像
鉴于活细胞和拟南芥的良好成像能力，我们进一步研究了 Probe-HMP 在小鼠中可视化内源·OH 的能力。 将小鼠分为三组：第一组为对照组，腹腔注射Probe-HMP； 第二组为实验组，用PMA预处理60分钟，然后腹腔注射Probe-HMP 30分钟。 第三组用抑制剂Tempol预处理30分钟，然后注射Probe-HMP 30分钟。如图所示，对照组小鼠在0、10、20、30 min时荧光强度的变化随着注射Probe-HMP时间的增加而逐渐增大； 然而，实验组的荧光强度高于对照组，如图所示。 由于PMA可以产生大量的内源性·OH，这一结果表明ProbeHMP具有一定的渗透性，可以与PMA诱导的·OH反应进行体内荧光成像。 为了进一步证明小鼠体内的荧光是由·OH引起的，我们还研究了Tempol作为·OH抑制剂的作用。 从图可以看出，经过Tempol预处理的小鼠的荧光强度比未处理的小鼠弱很多，表明Probe-HMP可以用于内源性和诱导性·OH的特异性成像。 在小鼠中。 然后，通过ImageJ对小鼠图像的相对荧光像素强度进行定量，并将PMA处理60分钟和ProbeHMP处理30分钟的小鼠的荧光像素强度定义为1.0。 如图所示，对照组 (a−d) 在 0、10、20 和 30 分钟时的荧光强度约为 分别为33.44%、42.68%、61.03%和77.97%。 此外，实验组（f−i）在0、10、20和30分钟时的荧光强度约为。 分别为 48.38%、72.62%、84.93% 和 100%。 当注射清除剂 Tempol 时，标准化荧光强度约为 对照组为38.05%，实验组为66.06%。 为了进一步确定Probe-HMP的荧光信号是否在器官中积累，对注射Probe-HMP 60 min的小鼠进行实验动物解剖，获取心、肝、脾、肺、肾组织进行荧光成像。Probe-HMP在体内具有良好的渗透和积累。 其中，肝脏作为主要代谢器官，比其他器官表现出更大的荧光增强。 此外，我们尝试对肝叶切片进行HE染色实验。与对照组相比，注射Probe-HMP的实验组没有出现明显的肝损伤； 结果表明，Probe-HMP具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性，不会造成肝损伤，而PMA诱导组的肝脏出现明显的肝纤维化，经启动子PMA预处理并注射Probe-HMP。 这一现象表明PMA诱导组小鼠产生的·OH会引起肝损伤。 总体而言，上述研究结果表明，Probe-HMP 负载小鼠的荧光确实是由·OH 的作用产生的，Probe-HMP 是体内内源性·OH 特异性检测和成像的有前途的工具。
总结
这项工作的重点是我们通过将 3-甲基吡唑啉酮部分连接到由肼基团形成的稳定的近红外荧光团 AXPI-NH2 上，成功设计和合成了一种用于检测·OH 的新型近红外荧光探针。 由于·OH与3-甲基吡唑啉酮部分之间发生特定的单电子氧化反应，导致Probe-HMP分子内推拉电子效应发生变化，因此Probe-HMP能够以优异的选择性立即识别·OH，从而实现·OH的高灵敏、选择性检测。 Probe-HMP表现出优异的体外检测性能，例如瞬时响应、24 nM的低检测限以及不受其他ROS干扰的优异选择性。基于·OH 启动子 PMA 和清除剂 Tempol 作用的结果表明，Probe-HMP 可用于 HepG2 细胞、拟南芥和小鼠中内源性·OH 的检测和生物成像。 此外，Probe-HMP 对小鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾）内源性·OH 的荧光成像显示出优异的特性。 更重要的是，Probe-HMP可以实现HepG2细胞铁死亡过程中内源·OH的检测，揭示铁死亡伴随着显着的·OH生成。 鉴于·OH在诱导氧化损伤和铁死亡中的重要作用，Probe-HMP可能具有探索与铁死亡相关的·OH的生理功能和病理过程的潜力。
参考文献
IlluminationofHydroxylRadicalGeneratedinCellsduringFerroptosis,Arabidopsisthaliana,andMiceUsingaNewTurn-OnNear-InfraredFluorescenceProbe，QiuyueWang,HaiyangJi,YitongHao,DongliJia,HongyuMa,ChangyingSong,HonglanQi,ZhaoLi,*andChengxiaoZhang*， Anal.Chem.，https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c03824
