内容提要
本研究创新性地采用供体工程策略来开发从近红外（NIR） I到近红外（NIR） II发射的半花青素染料（Hcys）。将性能优异的Hcy包裹在两亲性胶束中，与乳酸氧化酶（PLH1100）形成纳米组装体。PLH1100在980 nm处具有光谱吸收，光热转换效率为58.7%，具有NIR-II肿瘤成像能力。除了光热消融肿瘤外，PLH1100还能调节乳酸代谢，激活免疫原性细胞死亡，改善肿瘤微环境，促进T细胞浸润活化。进一步研究表明，PLH1100能有效杀伤人和鼠GBM细胞，抑制BALB/c-nu小鼠原位U87肿瘤生长，增强fn14靶向BiTE对C57BL/6小鼠原位GL261肿瘤的治疗效果，达到“1+1>2”的协同治疗效果。
合成和光物理性质研究
我们设计了三种Hcy分子的变体，以1-乙基苯（c,d）碘的平面部分为电子受体，以甲氧基、N、二乙基和1,4-二乙基-十氢喹啉为电子给体，以双键为桥。我们观察到1,14二乙基-十氢喹啉基团促进了吸收和发射光谱的红移。值得注意的是，它的最大吸收波长超过1000 nm，最强发射波长在1100 nm（命名为NIR-II Hcy1100）。而甲氧基取代分子和N，N-二乙基取代分子的最佳发射波长分别为800 nm（近红外Hcy800）和970 nm（近红外Hcy970）。然而，两种分子都表现出较窄的吸收光谱，在900 nm处的荧光吸收可以忽略不计。综上所述，与甲氧基和N，N-二乙基取代相比，1,4二乙基-十氢喹啉取代的Hcy具有优异的光物理性能，是一种适合于GBM PTI的有机光敏剂。因此选择NIR-II Hcy1100与Fn14×CD3 BiTE联合治疗。
PLH1100的制备与表征
基于其高效的递送和脑靶向能力，DSPE-PEG2000Ang-2被认为是一种有前景的靶向治疗GBM的纳米平台。本研究采用DSPE-PEG2000-Ang-2包封NIR-II Hcy1100，然后静电负载LOX构建PLH1100纳米颗粒。通过最大吸收峰从730 nm到800 nm的红移和一个≈1150 nm的荧光发射峰证实了自组装过程。此外，通过透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）测定了纳米复合材料的粒径，发现纳米复合材料形成了平均直径为206 nm的均匀球体。此外，LOX的存在或不存在（指定为PH1100）影响了纳米颗粒的zeta电位，其平均电位分别为- 40.2 - - 31.0 mV，而游离LOX的电位为≈12.0 mV，表明LOX与纳米颗粒成功结合。采用紫外-可见分光光度法测定NIR-II Hcy1100和LOX的浓度。结果表明，PLH1100中NIR-II Hcy1100的浓度为404.5 μ mL−1，LOX的浓度为375.8 μ mL−1。在980 nm激光照射下，记录了plh110的体外光热效应。用980 nm激光在0.5 W cm−2下照射10分钟，导致不同浓度PLH1100的PBS快速升温。此外，我们还记录了10 μg mL−1 plh110在不同激光强度下10 min的温度变化。结果表明，光热效应与PLH1100浓度和激光照射强度呈正相关。在980 nm激光（0.5 W cm−2）下，plh110水溶液（15 μg mL−1）的光热加热和冷却曲线如图所示。冷却时间与ln（温度）的线性拟合如图所示，从中我们计算出PLH1100的PCE为58.7%。在浓度为15 μg mL−1时，评估了plh100光热效应的稳定性。经过多次激光辐照后，其峰值温度保持在≈66°C，性能没有明显下降，显示出良好的光热稳定性。
PLH1100体外诱导免疫原性细胞死亡的研究
plh100处理GL261和U87细胞在980 nm激光照射6 h下HMGB1有明显释放，且光照组细胞外荧光强度远高于对照组和黑暗组。同样，光处理后CRT的表达和ATP的释放也明显增加。PLH1100的光热效应，以及LA的消耗，不仅可以有效地杀死肿瘤细胞，还可以刺激显著的ICD。我们构建了Fn14×hCD3 BiTE（简称hBiTE），可以介导人T细胞靶向U87细胞系。为了进一步评估PTI通过激活ICD联合BiTE的协同抗肿瘤效果，我们还表达了一个Fn14×CD3 mBiTE（简称mBiTE），它能够介导小鼠T细胞杀死GL261-hFn14/luc（一种表达人Fn14蛋白和荧光素酶的小鼠GBM细胞系）。我们的结果表明，mBiTE的分子量在55-70 kDa之间，与hBiTE相似，表明mBiTE已经成功构建和纯化。在免疫介导杀伤评价中，mBiTE （0.1 μ mL−1）表现出优异的杀伤效果，在效应细胞与靶细胞比为8:1、杀伤时间为4 h的情况下，平均杀伤率为55%。在不同浓度梯度下的后续评价显示，mBiTE的EC50为0.064 μ mL−1。在相似的条件下，还评估了协同治疗策略。我们评估了PLH1100的PTI对GL261-hFn14/luc的杀伤作用。激光照射后，光热效应改变了肿瘤细胞的形态，导致部分细胞死亡。然后，检测激光照射后4、8、12 h分别添加mBiTE或/和小鼠T细胞（mT细胞）的杀伤效果，结果表明，仅添加mBiTE或mT细胞对GL261-hFn14/luc的杀伤效果没有显著提高。激光照射后同时加入mBiTE和mT细胞的杀伤效果显著，强于只加入mBiTE或mT细胞的处理组。此外，在人体免疫细胞细胞毒性实验中也观察到这种协同治疗作用，激光照射后同时添加hBiTE和hT细胞对U87细胞的杀伤作用比其他四组更明显。最后，考虑到光热效应和mbit介导的mT细胞活性都伴随着DAMPs和炎症因子的释放，有助于淋巴细胞的增殖。因此，我们使用CytoTell Red来监测mT细胞的增殖。共培养杀伤24 h后，协同处理组mT细胞信号强度下降34.2%，高于非协同处理组（分别为24.7%和10.5%）。这进一步表明，协同作用下的mT细胞更活跃，进行了更多的增殖分裂。同样，联合处理下的hT细胞信号强度较其他组明显降低。
PLH1100在BALB/c-nu小鼠原位U87模型中的生物分布成像及PTI治疗效果评价
我们首先使用transwell模型评估其在体外穿过血脑屏障的能力。在U87和GL261-hFn14/luc下腔细胞中检测到的红色荧光表明，经Ang2修饰的PLH1100可以有效穿透血脑屏障，而未经修饰的PLH1100穿透能力非常有限。随后，我们评估了PLH1100在不同时间点携带原位U87肿瘤的BALB/c-nu小鼠中的动态分布。结果显示，plh100在给药3 h后在颅内肿瘤中积累，在12 h时荧光强度达到峰值，随后逐渐降低。在监测期间，肝脏被确定为plh100积累的主要器官，在给药后9小时荧光强度最高，其次是肺和肾脏。NIR-II荧光成像具有优异的深层组织穿透性、低背景噪声和高分辨率的特点。考虑到NIR-II Hcy1100的发射光谱超过1100nm，我们采用NIR-II成像来评估PLH1100在颅内肿瘤内的动态分布。如图所示，与cy5.5标记的纳米颗粒的成像特征一致。给药后3 h可见肿瘤成像，12 h荧光强度达到峰值。然后，体内光热效应测量显示，在980 nm激光照射（0.5 W cm−2）下，治疗组颅内温度随时间逐渐升高，6 min内达到55℃，满足轻度光热治疗的要求，而对照组无明显温升。我们使用BALB/c-nu小鼠原位U87肿瘤来评估PLH1100的治疗效果及其对ICD的激活作用。建立原位U87模型7天后，每只小鼠接受单剂量plh100 (10 mg kg−1)，12 h后进行980 nm激光治疗。每次激光照射6 min，重复4次。MRI监测肿瘤生长情况。随着时间的推移，对照组、PBS+Light组和PLH1100+Dark组的肿瘤体积比PLH1100+Light处理组增大更多。第21、28天，plh100 +Light组的平均肿瘤体积显著小于其他3组（p < 0.01）。相应的，与其他三组相比，PLH1100+Light处理组的小鼠存活时间更长。进一步的组织病理学分析显示，plh100 +光处理组ki67阳性率较低，tunel阳性率较高，肿瘤凋亡明显，说明光热作用在一定程度上减缓了肿瘤增殖，诱导肿瘤死亡。重要的是，我们还评估了诱导的DAMPs，如HMGB1和CRT。PLH1100+Light处理显著促进核HMGB1的释放和细胞外CRT的表达，有助于激活抗原提呈细胞，增强机体的肿瘤免疫应答。
总结
本研究采用供体取代工程的方法，开发了3种具有D-π-A结构的hhy基分子，最终选择了光谱性能最好的分子来构建PLH1100纳米颗粒。plh100作为纳米组合体具有脑靶向性、肿瘤富集性、光稳定性和生物相容性等优越性能，具有优异的光热转换效率和NIR-II肿瘤成像，非常适合用于脑GBM的PTI治疗。plh100还表现出对LA代谢和ICD激活的优越调节，从而改善GBM的酸性和免疫抑制特性，并激活TME。令人兴奋的是，plh100显著增强了fn14靶向BiTE药物的疗效，实现了大于各部分之和的协同效应。
参考文献
Donor Substitution Engineering of HemicyanineNanoparticles to Reprogram the Tumor Microenvironmentand Enhance Fn14-Targeted BiTE for GlioblastomaPhotoimmunotherapy， Gaowei Li, Shichao Jiang, Zongliang Zhang, Xiaoyin Liu, Kai Wu, Peng Liu, Mei Yang,Ting Zhou, Jiamei Xiao, Nini Xin, Xiaoyang Wu, Zhihong Chen, Jie Ding, Chengheng Wu,Dan Wei, Jing Sun, Aiping Tong,* Hongsong Fan,* and Liangxue Zhou*， Adv. Funct. Mater. 2024, 2413847，
