内容提要
本文提出了侧链苯基异构化诱导空间偶联构建A-D-A型NIR-II pta，同时增强荧光亮度和光热性能。设计并合成了三对相互异构的荧光团，其苯基分别位于侧链的外侧（o系列）和内侧（i系列）。苯基的位置异构化使o系列晶体与i系列不同，侧链上的苯基与主链之间具有很强的空间共轭性，并形成互锁的平面网络。所有的o系列纳米颗粒（NPs）都表现出红移吸收，增强的NIR-II发射，以及比i系列纳米颗粒更好的光热性能。o系列的重要成员o-ITNP NPs在促进NIR-II血管造影、肿瘤定位和NIR-II成像引导的肿瘤光热治疗方面表现出疗效。
结果与讨论
通过无金属催化Knoevenagel反应，高效合成了三组A-D-A结构的o-系和i系异构体，阐明侧链苯基位置异构化对分子构象、分子间堆叠和材料性能的影响。以二氢辛二烯二噻吩和二氢二噻吩-s-茚二烯二噻吩为强供体骨架，与2-（3-氧-2,3 -二氢- 1h -环戊[b]萘-1 -乙基）丙二腈和2-（4-氧环戊[c]噻吩-6 -乙基）丙二腈配对，得到了三个侧链外侧有苯基的o系列荧光团（o-ITNP， o-ITCT和o-IDTCT）。相应的i系列荧光团，i-ITNP， i-ITCT和iIDTCT，与o系列具有相同的共轭主链，但在侧链内侧的苯基位置不同。
为了表征o和i系列荧光团在溶液状态下的光学性质，在四氢呋喃（THF）中获得了吸收光谱和荧光光谱。由于化合物具有广泛的π共轭体系和强的D-A相互作用，所有化合物在500-800 nm范围内具有明显的吸收并发出近红外荧光。在具有相同共轭结构的i系列和o系列荧光团中也观察到类似的荧光。在660 nm激光照射下，o系荧光团的近红外荧光强度明显高于i系荧光团，这可能是由于侧链末端的苯基限制了o系烷基链的移动。为了提高有机分子的疏水性和生物相容性，采用纳米沉淀法将6个疏水性A-D-A型荧光团与1,2-二硬脂酰- cn -甘油-3-磷酸乙醇胺- n-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（DSPEmPEG2000）共组装成类脂质体NPs。所有NPs在水中具有良好的分散性，通过动态光散射（DLS）分析，其直径为100-150 nm，允许其通过增强的渗透性和滞留性（EPR）效应在肿瘤部位被动积累。透射电镜（TEM）图像显示，o-ITNP纳米颗粒呈现一致的球形形貌，直径约为123 nm。通过比较i系和o系NPs在水中的吸收光谱和荧光光谱，研究侧链苯基异构化对NPs光物理性质的影响。o-ITNP和i-ITNP具有相同的共轭主链，在NPs状态下表现出从可见光到近红外范围的显著吸收。与i-ITNP NPs相比，o-ITNP NPs的最大吸收峰（λmax）明显红移（760 vs. 721 nm），在808 nm处的最大值更高（4.55×104 vs. 0.85×104 Lmol-1 cm-1）。在660 nm的激光激发下，两种NPs都显示出明亮的NIR-II发射，延伸至1300 nm。特别是，o-ITNP纳米材料的荧光发射明显增强，总QY为5.6%，是i-ITNP纳米材料（2.8%）的两倍，超过了大多数报道的NIR-II有机纳米材料。通过进一步分析NIR-II窗口（>1000 nm）的QY和荧光亮度（qyx /），可以观察到与i-ITNP NPs相比，o-ITNP NPs在这两个参数上都表现出显著的增加。其中，o-ITNP NPs的NIR-II QY和荧光亮度分别是i-ITNP NPs的2.1倍和10.5倍，此外，另外两组具有不同供体或受体单元的荧光团NPs （i-ITCT NPs vs. o-ITCT NPs，以及i-IDTCT NPs vs. o-IDTCT NPs）的光学性质进行了评估，以证明侧链苯基异构化策略的可行性和可推广性。与i系列的i-ITCT NPs和iIDTCT NPs相比，o-ITCT NPs和oIDTCT NPs的λmax分别红移了18和24 nm。
值得注意的是，与i系列NPs相比，o-ITCT NPs和o-IDTCT NPs的NIR-II荧光亮度和QY也有所增强，这与o-ITNP NPs和i-ITNP NPs的结果一致。在808 nm激光激发下，捕获水中所有NPs的NIR-II荧光图像。0系列NPs的NIR-II亮度明显高于i系列NPs。
我们评估了i系列和o系列NPs在水溶液中的光热特性。在808 nm激光连续照射下，i-ITNP NPs、i-ITCT NPs和i-IDTCT NPs的温度分别从20.0℃左右上升到40.4℃、33.4℃和22.9℃。其PCE分别为41%、32%和0%。相比之下，它们在水溶液中对应的10系NPs （o-ITNP NPs、o-ITCT NPs和o-IDTCT NPs）表现出更高的温度变化和PCE，记录的峰值温度分别为61.0℃、46.9℃和27.3℃，对应的PCE分别为76%、45%和9%。计算的光热性能（pcex]值）表明，oITNP NPs、o-ITCT NPs和o-IDTCT NPs分别是i系列NPs的10.3倍、10.9倍和42.5倍。这些数据清楚地表明，侧链苯基异构化同时增强了NIR-II纳米材料的荧光亮度和光热性能。以2,7-二氯二氢荧光素（DCFH）为检测剂，以商业染料吲哚菁绿（ICG，单线态产氧效率报道为0.2%）为参考，评估了o-和系列NPs的活性氧（ROS）生成能力。所有NPs的ROS生成效率都略好于ICG，这表明光热效应是这些NPs作为opta使用时的主要影响因素。808 nm激光开/关5次循环后，ICG的光热稳定性表现较差，在相同条件下温度下降到初始水平的50%以下。相比之下，所有o系列和i系列NPs都表现出强大的光热稳定性，变化可以忽略不计。此外，研究了o-ITNP纳米粒子在不同浓度和激光功率下的光热性能。研究结果表明，温度升高与o-ITNP NPs的数量以及激光功率密度呈正相关，强调了有效调节光热行为的能力。值得注意的是，在808 nm激光照射6 min后，o-ITNP纳米粒子在20 μM浓度下的温度升高至61.0℃，表现出优异的光热性能。o-ITNP NPs所表现出的出色的光热特性使其成为体内肿瘤光热治疗的潜在候选者。
为了研究侧链苯基异构化对激发态能量衰减过程的影响，本研究选择具有相同骨架的o-ITNP NPs和i-ITNP NPs作为研究对象。o-ITNP NPs和i-ITNP NPs的荧光寿命τF分别为1.25 ns和1.86 ns。由方程kr=QY/τF和knr=(1/QY1)kr推导出的辐射衰减率（kr）和非辐射衰减率（knr）， oITNP np的计算值分别为4.47×107 s-1和8.00×108 s-1，超过了i-ITNP np的值，kr和knr分别为1.52×107 s-1和5.35×108 s-1。在其他0和i系列NPs中也观察到类似的结果。这些结果与观察到的NIR-II荧光亮度和光热效应的增强一致，突出了侧链苯基异构化策略的有效性。受o-ITNP NPs出色的光热特性启发，我们评估了o-ITNP NPs对癌细胞的消融效果。在体外实验之前，对与o-ITNP NPs共培养的4T1癌细胞进行时间依赖性荧光成像，以评估NPs的细胞摄取情况。如图所示，随着培养时间的延长，细胞内的红色发射强度逐渐增加，表明细胞对o-ITNP NPs的吸收效率很高。随后，使用标准噻唑蓝溴化四唑（MTT）测定法评估细胞活力。在没有808 nm激光照射的情况下，即使在高浓度（30 μM）下，o-ITNP NPs对4T1细胞也表现出不明显的细胞毒性，表现出优异的生物相容性。在808 nm激光照射下，在10 μM以下的浓度下，细胞存活率保持在90%以上，而在30 μM的浓度下，4T1细胞几乎完全失活，表明有很强的光诱导抗癌活性。此外，通过与4T1细胞共染色calcein-AM（绿色，活细胞标记）和碘化丙啶（红色，死细胞标记），证实了o-ITNP NPs的光治疗作用。当显示了808 nm激光照射时，随着o-ITNP NPs浓度的升高，红色荧光逐渐增加。值得注意的是，在浓度为30 μM时，强烈的红色荧光覆盖了整个屏幕，表明细胞完全消融，与MTT实验结果一致。然而，o-ITNP NPs或单独激光治疗的毒性可忽略不计。流式细胞术分析显示，o-ITNP NPs和激光治疗后，85.4%的4T1细胞发生凋亡，4.59%的4T1细胞发生坏死，而对照组的凋亡或坏死极少。这些结果进一步支持了oITNP NPs卓越的生物相容性和有效的光诱导癌细胞根除能力。o-ITNP NPs所显示的显著的NIR-II荧光亮度促使我们对o-ITNP NPs在活体小鼠体内的血管成像能力进行评估。将LP滤波器的范围从900 nm扩展到1300 nm，导致成像分辨率逐步增强，在1300 nm的LP滤波器中达到最大SBR（3.84）和FWHM （148.5 μm）。此外，使用时间依赖性血液荧光成像评估o-ITNP NPs的血液半衰期，显示荧光亮度随时间逐渐降低。通过曲线拟合分析确定o-ITNP NPs的半衰期为1.05 h。基于o-ITNP NPs显著的体内NIR-II成像性能，初步评估了肿瘤部位积累的潜力。如图所示，在注射o-ITNP NPs之前，小鼠表现出最小的自身荧光干扰，提供了低背景信号。静脉注射o-ITNP NPs后，肿瘤部位的荧光信号渐进式增加，表明肿瘤特异性富集有效。值得注意的是，荧光强度在注射后24 h达到峰值，随后由于代谢过程而下降。注射后72h，解剖肿瘤组织和主要器官，定量分析o-ITNP NPs的生物分布。在肿瘤区域检测到大量的NIR-II荧光信号，表明o-ITNP NPs具有显著的肿瘤靶向能力。肝脏和脾脏对代谢过程至关重要，与其他器官相比，它们的荧光信号明显升高。这些发现强调了o-ITNP NPs显著的体内NIR-II成像和肿瘤靶向特性。通过体内光热成像评估o-ITNP NPs的特殊光热性能。如图所示，808 nm激光照射后的3分钟内，肿瘤部位的温度从34.2℃迅速上升到49.7℃。随后，辐照5分钟后达到约50.2°C的温度平台，强调了o-ITNP NPs的可靠PCE。相比之下，在808 nm激光照射下，PBS处理小鼠的温度变化最小。这些研究结果表明，o-ITNP NPs具有肿瘤选择性传递和位点特异性光热效应，有望成为精确癌症治疗的纳米材料。
o-ITNP NPs的优异表现鼓励我们进一步评估4T1乳腺荷瘤小鼠的体内杀瘤活性。将小鼠分为1个实验组和3个对照组，分别给予不同的治疗。对照组分别给予PBS、PBS+L和o-ITNP NPs，实验组给予o-ITNP NPs+L。监测肿瘤进展和体重变化14天。在实验组中，14天后观察到实体瘤生长受到明显抑制，肿瘤完全根除。相反，在对照组中，肿瘤生长迅速，没有受到抑制。所有组都出现了最小的体重减轻，表明o-ITNP NPs具有良好的体内生物相容性。此外，在治疗第14天对小鼠实施安乐死，对肿瘤切片进行组织学和免疫组织化学分析，以验证o-ITNP NPs的体内光疗效果。苏木精-伊红（H&E）染色结果显示，o-ITNP NPs+L组肿瘤组织明显受损，而对照组肿瘤细胞保持活力且致密堆积。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色显示o-ITNP NPs+L处理的肿瘤细胞明显凋亡或坏死。
总结
通过非金属Knoevenagel反应得到了三对相互异构的o-和i-系列有机分子，其中苯基分别位于侧链的外侧和内侧。所有化合物在NPs状态下均表现出较宽的NIR-I吸收带和较强的NIR-II荧光发射，发射波长可达1300 nm。值得注意的是，与i系列相比，o系列NPs在808 nm处表现出红移的吸收波长和显著增加的吸收波长。在808 nm激光激发下，与系列相比，0系列NPs表现出更高的NIR-II荧光亮度和增强的光热性能。荧光衰减曲线分析表明，0系列NPs的kr和knr值比其系列NPs大，从而提高了荧光强度和光热产量。晶体学分析揭示了侧链苯基与相邻层骨架之间的碳氢···π相互作用。在同一层内，由于侧链的屏蔽作用，i系分子的相互作用可以忽略不计。相反，o系侧链苯基的位置异构化导致侧链苯基与共轭主链之间形成空间共轭，并在同一层分子骨架之间形成构象互锁。因此，o系聚集体具有更紧密的分子堆叠和更大的π共轭面，这使得它们具有更强的电子相互作用和更小的HOMO-LUMO能隙，大大加速了辐射和非辐射过程，最终导致吸收波长红移，增加了π，改善了NIR-II发射和光热性能。作为o系列的候选材料，o-ITNP NPs在808 nm处具有较高的光热系数，光热性能优越，NIR-II荧光亮度令人满意。
参考文献
Side Chain Phenyl Isomerization-Induced Spatial Conjugation forAchieving Efficient Near-Infrared II Phototheranostic Agents， Chunbin Li, Mengfan Yao, Guoyu Jiang, Lina Feng, Yifan Wu, Renmanduhu Sha,Yonghai Li,* Ben Zhong Tang, and Jianguo Wang*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202419785， https://doi.org/10.1002/anie.202419785
