内容提要
诱导热下垂的光敏剂(PS)的开发可能是光动力治疗(PDT)的明星，特别是在缺氧肿瘤微环境中产生活性氧(ROS)的I型光敏剂。由于焦亡是最近发现的一种细胞死亡途径，它有望在肿瘤学中推进PDT，其中PSs起着关键作用。在此，我们开发了一种名为Th-M的具有聚集诱导发射(AIE)特征的PS，用于I型PDT治疗舌鳞癌(TSCC)。Th-M因其特殊的线粒体靶向能力而引人注目，该能力可触发线粒体功能障碍，导致白光照射下Caspase-3和Gasdermin E (GSDME)分裂，诱导TSCC细胞焦亡。我们的研究证实了Th-M在体外破坏癌细胞和体内抑制肿瘤生长方面的有效性，同时也证明了良好的生物安全性。这项工作开创了Th-M作为线粒体靶向的I型PS的应用，它利用焦亡机制，为TSSC的治疗提供了一种有效的方法，对未来癌症的PDT有希望的意义。
结果与讨论
分子设计和光物理性质
Th-M和PhM的合成过程如图所示。这两个化合物都是由相应的醛前体与4-吡啶乙腈通过Knoevenagel缩合合成的，然后用(4-溴丁基)三苯基溴化磷处理。Ph-M的吸收峰波长为499 nm，而Th-M的吸收峰波长为547 nm。Th-M的显著红移和增强的吸收系数表明，在给电子部分和吡啶段之间存在更明显的分子内电荷转移(ICT)相互作用，表明其具有增强光物理活性的潜力。35−37为了评估Th-M和Ph-M的AIE特性，使用由甲苯和二甲基亚砜(DMSO)组成的二元溶剂体系制备了一系列稀释溶液，以诱导不同程度的分子聚集。Ph-M的荧光强度随着甲苯比的增加而逐渐增强，达到80%和95%时，荧光强度激增，约为纯DMSO中观察到的36倍。同样，Th-M的荧光强度也呈现出类似的上升趋势，相对于初始强度增强了约4倍。这些观察证实了Ph-M和Th-M的典型AIE行为，如前所述当溶剂的甲苯含量达到95%时，Th-M和Ph-M的最大发光点分别定位在630 nm和610 nm，表明它们在聚集态下具有发光性能。观察到的Th-M和Ph-M的可见吸收谱表明了它们在癌细胞光动力消融中的潜在适用性，特别强调了白光照射下TSCC的治疗管理。
为了明确产生的ROS的具体种类，使用了一套选择性探针:9,10-蒽二基-双(亚甲基)二丙二酸(ABDA)用于单线态氧1O2)检测，二氢霍达明123 (DHR123)用于超氧阴离子(O2·−)检测，羟基荧光素(HPF)用于羟基自由基(HO·)检测。在白光照射下，Th-M和Ph-M存在时，ABDA没有出现光谱偏差，说明没有明显的1O2生成。相反，图中阐述了在白光照射下Th-M或Ph-M存在时DHR123荧光的明显增强。同样，在类似的条件下，用Th-M或Ph-M记录了HPF荧光的增强。
线粒体靶向研究
PSs的细胞摄取和亚细胞分布是决定其治疗效果的关键。45,46 CAL27细胞系内Th-M和Ph-M的细胞摄取图像和相应的轮廓分别。在0.5 h时，Th-M和Ph-M都明显进入细胞，主要定位在细胞质内。这两种化合物的荧光强度在间隔1 h后趋于稳定，表明它们在CAL27细胞内稳定积累。为了验证Th-M和Ph-M的细胞内定位，使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进行共定位测定。图中说明Th-M与已建立的细胞器特异性追踪器共定位:线粒体追踪器(MitoTracker)、溶酶体追踪器(LysoTracker)和脂滴追踪器(Nile Red)。MitoTracker的红色荧光信号与Th-M的绿色荧光信号的共定位尤为明显，Pearson相关系数(PCC)为0.91。相比之下，Th-M与LysoTracker和Nile Red表现出轻微和中度的共定位，PCCs分别为0.26和0.63，表明Th-M以高特异性优先靶向线粒体。相反，Ph-M与MitoTracker的共定位最小，PPC为0.07。如图所示，Ph-M与其他细胞器特异性追踪器的共定位研究显示，LysoTracker的PCCs为0.54,Nile Red的PCCs为0.74，这表明Ph-M更倾向于溶酶体和脂滴，而不是线粒体。考虑到线粒体通过糖酵解促进能量产生在癌细胞增殖和转移中的关键作用47,Th-M在线粒体内定位并产生i型ROS的能力可能被策略性地利用来破坏线粒体功能，从而阻碍癌症进展。
体外ROS的生成
48、49个CAL27细胞与Th-M或Ph-M孵育1.5 h后，加入DCFH-DA培养基。荧光强度如图所示，Th-M处理的CAL27细胞在白光照射(12.5 mW/ cm2) 5 min后荧光明显增强。而Ph-M处理后的CAL27细胞荧光不明显。这种差异可能是由于Th-M和Ph-M在细胞摄取后的亚细胞定位不同。12,45鉴于在大多数真核细胞中，线粒体是通过ETC产生细胞内ROS的主要位点，因此可以推断，靶向线粒体的Th-M通过破坏ETC来增强ROS的产生。MitoTracker Deep Red荧光减弱，GreenNuc荧光增强，表明Th-M联合白光触发线粒体损伤，激活Caspase-3。然而，无论是单独使用Ph-M还是Ph-M联合白光处理都不会引发线粒体损伤。因此，这些发现表明Th-M相对于Ph-M具有更强的细胞内ROS生成能力。基于Th-M和Ph-M在体外产生ROS的证据，我们利用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)检测了这些化合物在黑暗和白光照射条件下的细胞毒性作用。如图所示，即使在无光条件下，Ph-M浓度为5 μM时也表现出细胞毒性。与之形成鲜明对比的是，图中显示，在相同浓度下，Th-M在黑暗条件下的细胞毒性作用明显减弱。此外，图显示，Ph-M在100 mW/cm2的高光强下诱导光毒性，而Th-M在12.5 mW/cm2的低光强下引起明显的光毒性。结果表明，Th-M在无光条件下表现出较低的细胞毒性，但在5 μM的中等浓度白光照射下表现出较强的细胞毒性。
TH - M诱导的焦亡机制分析
为了更深入地了解这些细胞转化，我们使用Cell Mask Green对质膜进行染色，便于对CAL27细胞形态进行监测。PBS、PBS + Light和ThM对照组的质膜保持了正常和完整的外观。与此形成鲜明对比的是，Th-M + Light组的CAL27细胞出现了扭曲的膜，其特征是肿胀和形成泡状结构。这种泡状的形态是正在经历热亡过程的细胞的标志。为了阐明白光照射下th - m诱导CAL27细胞的作用机制，我们采用Western blot方法检测了不同处理后不同时间间隔内th - m诱导CAL27细胞蛋白表达水平的变化。分别在单独Th-M或Th-M联合白光处理后2、6、10 h采集CAL27细胞的12、30、52个样品随着时间的推移，被切割的PARP/PARP的比值仍然没有明显的变化。这种缺乏变异表明凋亡不太可能是Th-M处理的CAL27细胞肿胀和冒泡的驱动力。在第6和10 h, Th-M和Th-M + Light组之间ProCaspase-3的表达差异显著，。Th-M + Light组中也检测到Cleaved-Caspase-3。Caspase-3是裂解GSDME的关键蛋白酶，导致其n端片段(GSDME- n)的释放，使GSDME- n在焦亡后蛋白水平升高，GSDME- fl在焦亡后蛋白水平降低。在这些指定的时间点，Th-M +光照组的全长GSDME (GSDME- fl)水平与未光照的Th-M组相比明显降低。相反，与Th-M组相比，Th-M + Light组的GSDME-N水平升高。，GSDME-N/ GSDME-FL的比值在6和10 h时有明显的变化。这些蛋白表达水平的变化表明，GSDME的裂解可能有助于启动焦亡，从而导致白光照射下Th-M处理后CAL27细胞死亡。
CAL27荷瘤小鼠体内PDT
我们通过皮下注射CAL27细胞诱导肿瘤形成，建立BALB/c裸鼠模型。随后将Th-M溶解于PBS中，以100 μL的体积给药。注射Th-M 24 h后，用白光照射肿瘤部位。PBS + Light组和Th-M + Light组的照射强度为60 mW/cm2，持续时间为20分钟。使用游标卡尺每隔两天仔细测量一次肿瘤的尺寸，从治疗后第0天到第18天。PBS组肿瘤体积明显增大，表明肿瘤进展迅速。PBS + Light组的生长轨迹与PBS组一致，说明该特定强度的白光不会阻碍肿瘤生长，同时也肯定了其生物安全性。此外，仅注射Th-M而不光照的Th-M组表现出与PBS组相似的生长模式，从而再次肯定了Th-M的生物相容性。与此形成鲜明对比的是，接受Th-M后再接受白光照射20分钟的组表现出明显的肿瘤生长抑制，并随着时间的推移逐渐消退。到第18天，Th-M + Light组的肿瘤体积仅比PBS组缩小了11.98%，明确表明Th-M的PDT疗效。在18天的治疗期结束时，所有小鼠都被安乐死，肿瘤和关键器官被切除以作进一步检查。与对照组(PBS、PBS + Light、Th-M)相比，Th-M + Light组的肿瘤明显变小。
总结
我们的工作基于两种基于AIE的I型PSs，即Th-M和Ph-M，包括光物理性质和ROS生成。虽然与Th-M相比，Ph-M在分子水平上表现出更优越的ROS生成，但在细胞水平上观察到一个有趣的逆转，ThM在细胞内ROS生成方面超过了Ph-M。这一悖论可归因于Th-M在癌细胞内的优先线粒体靶向，突出了亚细胞定位在ps设计中的重要性。体外细胞实验证实了Th-M在白光照射下通过引发焦亡来消灭癌细胞的强大能力，焦亡的特征是细胞肿胀和质膜破裂。此外，体内研究表明，Th-M能够在TSCC动物模型中根除肿瘤，同时保持良好的生物安全性，血液学分析和组织病理学评估证明了这一点。从这项研究中收集到的见解强调了策略性设计的基于AIE的PSs激活焦亡通路的潜力，为提高PDT治疗TSCC的疗效提供了一个新兴和有希望的途径。目前的工作将启发进一步研究能够诱导焦亡的基于AIE的PSs的靶向设计，从而完善癌症治疗的PDT模式。
参考文献
Mitochondria-TargetingAIEgensasPyroptosisInducersforBoostingType‑IPhotodynamic TherapyofTongueSquamousCellCarcinoma，YingPeng,RufanMo,MingwangYang,HuilinXie,FulongMa,ZeyangDing,SongWu,JackyW.Y.Lam, JuanDu,*JianquanZhang,*ZhengZhao,*andBenZhongTang，ACS Nano， https://doi.org/10.1021/acsnano.4c06808
