内容提要
是世界各地死亡的一个重要原因，对于许多种类的癌症，治疗并不成功。因此，有必要开发创新、有效和精确靶向的治疗方法。在这里，我们通过合理操纵配体结构开发了一系列Au(I)复合物(1-4)，从而通过化学光疗和诱导免疫原性细胞死亡实现肿瘤细胞特异性靶向和有计划的肿瘤根除。基于体外和体内雌性小鼠实验的综合探索表明，复合物4具有特异性肿瘤成像和内质网靶向能力，具有强大的治疗能力。机制阐明表明，其抗癌作用是由硫氧还蛋白还原酶抑制、高效活性氧产生和免疫原性细胞死亡的协同作用引起的。这项工作提出了一个强大的Au(I)配合物在一个单一的系统内整合三种治疗方式的报告。
金(I)配合物的设计合成
我们构思了将吡啶基AIE配体与NHC-Au(I)单元结合的想法。虽然我们之前开发了三种多功能吡啶基AIE配体配合五氟苯基金(I)配合物，并证明了抗癌应用，但它们仍然是中性分子，它们与细胞的结合亲和力需要增强。认识到这一挑战，成功整合基于吡啶的AIEgens与NHC-Au(I)单元将代表一种突破性的分子设计方法，考虑到AIEgens和碳结构固有的广泛可改性性。因此，我们选择了三种经典的吡啶基AIE配体，它们具有逐渐增强的供体(D)-受体(A)特征，以实现对发光波长和活性氧(ROS)生成能力的操纵。此外，我们还用三苯基膦单元取代了NHC配体，对其光物理和生物学性质进行了比较探索。根据上述设计策略，我们按照提出的合成路线系统地合成了Au(I)配合物1-4。与市售的光敏剂玫瑰红(RB)相比，你们的生产能力如何显著提高。配合物3的ROS生成能力最强，其次是配合物2和配合物4。虽然它们产生单重态氧(1O2)的能力存在一定差异，但配合物3和4表现出平行且最优的性能，其次是配合物2和配合物1。结果表明，在配合物1中加入噻吩和苯并噻唑，使配合物2-4具有更强的ROS生成能力。
体外肿瘤可视化及治疗研究
考虑到AIEgens在聚集状态下具有优异的发光优势，我们随后重点研究了目标配合物1-4的成像效果。不同肿瘤细胞分别用配合物1-4孵育。荧光成像结果显示，所有复合物对肿瘤细胞都表现出显著的成像性能。在确认复合物1-4在肿瘤细胞中的优异成像性能后，我们继续评估其在正常细胞中的成像性能。结果显示，在正常细胞中，所有复合物都没有明显的荧光信号，表明复合物1-4对肿瘤细胞具有特异性选择性。这种选择性归因于它们的Au(I)中心与肿瘤细胞中过表达的TrxR的特异性结合，正如我们之前的工作所证实的那样。在我们之前的研究中，设计的中性复合物TBP-Au在正常细胞和肿瘤细胞之间没有选择性。TBP-Au主要靶向溶酶体。由于TrxR的同工型主要在细胞质、线粒体或睾丸中表达，不同细胞器内的定位影响了选择性。因此，这意味着向Au(I)配合物中引入正电荷也很重要，因为它通过影响细胞器定位来影响其与TrxR的结合。因此，我们最初的设计策略的合理性，包括引入电荷，得到了很好的证实。我们基于之前研究中类似的共价对接方法，分析了复合物4与TrxR之间的相互作用。通过比较计算出的Au(I) -P和Au(I) -N配合物4的键能，我们推断吡啶基AIE配体应该在与TrxR相互作用之前或之后被替换。对接结果表明，Au-P键和Au-S键的键长分别为2.32 Å和2.38 Å，与之前的共价对接结果一致，验证了我们的对接方法。进一步分析了Ph3P-Au+片段在人硫氧还蛋白还原酶(hTrxR, PDB ID: 2ZZB)结合袋中的相互作用。结果表明，体积较大的PPh3基团插入到hTrxR的疏水腔中。Ph3P基团的三个苯环与周围的氨基酸(ASN418、ASN419和TRP407)主要通过疏水和范德华作用相互作用。这些相互作用对于增强分子靶向能力至关重要。
复合体4介导的体外ICD
合理设计的配合物4具有靶向细胞器的能力，并具有良好的光动力效应。随后，为了捕捉光激活过程中细胞的动态变化，选择复合物4为代表，对4T1细胞进行原位荧光成像。成像数据显示4T1细胞快速荧光响应，表明复合体4快速进入细胞并点亮细胞。有趣的是，在光照射下ROS诱导的氧化应激下，观察到细胞内部结构出现进行性肿胀和变形，如虚线圈所示。鉴于荧光共定位数据表明复合物4主要靶向内质网和线粒体，我们推测细胞内广泛的内质网区域也可能发生肿胀和变形。如上文所述，复合体4产生的ROS会对内质网造成损伤，并可能诱导内质网释放钙离子，从而引发内质网应激的发生。为了进一步验证内质网应激的发生，我们通过WB分析监测与内质网应激相关的C/EBP同源蛋白(CHOP)和葡萄糖调节蛋白(GRP) 78的表达水平47。在复合物4介导的PDT过程中，CHOP和GRP78的表达模式相似。与其他组相比，配合物4在光照下显著增加了GRP78和CHOP的表达，表明对严重内质网应激有实质性的响应。
体内肿瘤成像及治疗研究
在证实了复合物4在体外的显像和治疗效果后，我们进一步研究了其在体内的表现。考虑到配合物4的长波发光增强了穿透能力，我们推测它在深层组织中也可能具有优异的成像能力。因此，我们进一步研究了其在活体动物中的成像效果。通过静脉注射对荷瘤小鼠进行体内成像，并监测荧光强度随时间的变化。注射后4小时，在肿瘤部位检测到强荧光，荧光信号在肿瘤区域可持续长达96小时。这些发现表明复合物4具有长期肿瘤监测的重要潜力。鉴于其优异的体外抗癌性能，其在影像引导治疗中的应用前景十分广阔。96小时后，安乐死小鼠获得的主要器官和肿瘤组织图像在肿瘤部位出现强烈的荧光信号，证明复合物4的靶向作用。此外，作为代谢器官的肾脏和肝脏也显示出轻微的荧光，提示可能通过这些器官进行代谢。随后，使用4T1荷瘤BALB/c小鼠模型评估复合物4的体内抗癌功效。观察治疗21天后，对照组和单光组肿瘤生长几乎没有受到抑制，而“复合物4 + L”组肿瘤生长完全受到抑制)。此外，各组体重监测结果无显著差异，表明其生长趋势稳定，复合物4具有良好的生物安全性。21 d治疗期结束后，对小鼠实施安乐死，收集其主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)及肿瘤组织。肿瘤重量测量进一步支持复合物4 + L组显著抑制肿瘤生长的结论。
复合体4介导的体内ICD及相关肿瘤免疫应答
为了揭示复合物4在体内联合治疗具有优异抗肿瘤疗效的潜在机制，我们在治疗结束后从肿瘤动物模型中采集肿瘤组织和主要器官。肿瘤组织切片的免疫荧光分析显示，“复合物4 + L”组有明显的CRT暴露，进一步验证了复合物4介导的联合治疗在体内诱导内质网应激。CRT暴露作为一个突出的信号，通过与树突状细胞(dc)表面受体结合，促进树突状细胞(dc)成熟。这种相互作用增强了肿瘤抗原向T细胞的呈递，并引发随后的免疫反应。因此，使用流式细胞术(CD11c+， CD80+和CD86+)仔细评估了不同处理后DCs的成熟度，结果显示，与其他组相比，“复合物4 + L”组的DCs成熟度显著增强。成熟的树突状细胞将抗原呈递到T细胞中可以激发适应性免疫反应，其标志是产生T淋巴细胞(CD4+ T细胞和CD8+ T细胞)来对抗癌细胞。脾组织切片的免疫荧光染色强调，与其他三组相比，“复合物4+ L”组的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞计数升高。这一观察结果表明，在复合物4介导的联合治疗后，免疫反应更强，导致该组脾脏中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的募集数量增加。使用免疫荧光染色对肿瘤中的CD8+ T细胞、CD4+ T细胞和Foxp3+细胞进行进一步的水平检查表明，在“复合物4+ L”组中，CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的荧光强度升高，同时Foxp3+细胞的荧光强度显著降低这表明复合物4 + L组抗肿瘤免疫活性增强。
总结
本研究通过将NHCAu(I)和PPh3-Au(I)单元与AIE配体结合，设计了一系列配合物，取得了化疗、光疗、免疫治疗相结合的显著抗癌效果。体外实验证明了该系列复合物具有特异性肿瘤成像、细胞器靶向和强大的治疗能力。值得注意的是，其中以三苯基膦配体为特征的配合物4在所有评估方面都表现出最佳性能。对潜在机制的全面探索表明，复合物4的有效抗癌作用源于有效的TrxR抑制、高效的ROS生成和以DAMPs显著释放为特征的细胞氧化应激诱导的ICD的协同作用，其中内质网应激发挥了重要作用。随后的体内实验证实了复合物4出色的肿瘤成像能力，并通过激活免疫反应增强了其强大的治疗效率。因此，我们的精心设计不仅赋予Au(I)配合物精致的分子结构，使其成为有效的光敏剂，而且还强调了它们在体外诱导ICD和体内引起免疫反应的强大能力。这些发现强调了Au(I)-AIE复合物在联合治疗领域的巨大优势和前景，并进一步加强了精确免疫治疗。
参考文献
Strategically engineered Au(I) complexes for orchestrated tumor eradication via chemo phototherapy and induced immunogenic cell death，NaFeng, ZhenPeng，XinZhang, Yiling Lin,LianruiHu ， Ben Zhong Tang ，&JingZhang ，Nat.Commun| (2024) 15:8187，https://doi.org/10.1038/s41467-024-52458-4
