内容提要
轻度热疗光热疗法(mPTT)具有治疗潜力，对正常组织的损伤最小。然而，血管化不良的肿瘤区域严重阻碍了光热剂(PTA)的渗透，导致它们在mPTT期间的不均匀分布和随后的不均匀局部温度。低于42°C治疗阈值的区域可导致肿瘤不完全消融和潜在复发。此外，肿瘤抗凋亡和细胞保护途径，特别是激活的热抵抗，可以消除轻度高温诱导的肿瘤损伤。介绍了一种以亮氨酸修饰的生物启发光敏剂，以形成仿生纳米团簇(CP-PLeu纳米颗粒(NPs))，旨在实现肿瘤中快速均匀的积累。此外，CP-PLeu表现出光动力学效应，逆转肿瘤的热阻和生理修复机制，从而抑制肿瘤对高温的抵抗。随着NIR-II激光照射的加入，CP-PLeu优化了mPTT的治疗效果，为乳腺癌的微创治疗做出了贡献。
结果与讨论
光物理化学研究
合成了生物激发光敏剂CP-PLeu，由两段组成:具有电子“供体/受体”对的疏水共轭主链实现光转化效果，以及密集接枝亮氨酸的水溶性侧链，以增强生物相容性和肿瘤特异性。通过透射电镜(TEM)和动态光散射(DLS)证实，CPPLeu在水溶液中自组装成67.8 nm的颗粒。由于其共轭主链，CP-PLeu表现出理想的光物理性质，具有800至1300 nm以上(横跨NIR-I至NIR-II区域)的宽吸光度光谱，并在850-1400 nm(ex = 808 nm)和1100 - 1500 nm(ex = 1064 nm)处发射荧光峰。CP-PLeu的量子产率分别为2.2%(ex = 808 nm, IR1061为标准，1.8%)和0.442%(ex = 1064 nm, IR26为标准，0.05%)。由于其共轭体系，CP-PLeu可以有效地转换能量。因此，当用1064 nm (0.5 W cm−2)和808 nm (0.5 W cm−2,0.3 W cm−2)激光照射时，CP-PLeu (4 mg mL−1)产生的热量如图所示。在高功率激光(0.5 W cm−2)照射10 min下，CP-PLeu将水溶液加热到76.6℃(ex = 1064 nm)和73.4℃(ex = 808 nm)，差异可以忽略不计。在0.5 W cm−2的辐照功率下，808 nm激光对皮肤组织的表面损伤明显，而1064 nm激光对皮肤组织的表面损伤几乎没有观察到。这种差异可归因于组织对近红外激光的耐受性，其中808 nm激光0.5 W cm−2超过了生物组织的耐受性极限。将辐照功率降低至0.3 W cm−2可消除皮肤组织表面损伤，同时将溶液温度降低至50℃。理论计算表明，CP-PLeu在1064 nm激光照射下的光热转换效率为38.2%，而808 nm激光照射下的光热转换效率为32.8%。
细胞测试
将正常乳腺细胞与乳腺肿瘤细胞进行比较，发现后者中LAT蛋白过表达，促进BCAAs的摄取增强。为了验证bca修饰的生物光敏剂在肿瘤细胞中的有效积累，将另外两个BCAAs缬氨酸和异亮氨酸结合到相同的共轭主链上，分别形成CP-PVal和CP-Pile。为了比较，还合成了一种缺乏肿瘤特异性的中性聚乙二醇修饰共轭聚合物(CP-PEG)。由于CP-PVal、CP-PIle和CP-PEG具有共同的共轭主链，它们表现出与CP-PLeu相似的光物理性质。此外，统一调整NP大小。四种光敏剂显示均匀的荧光强度(ex = 808 nm)，与4T1乳腺癌细胞孵育，以评估细胞摄取效率。NIR-II荧光成像显示，与cp - peg处理的细胞相比，经BCAA修饰的光敏剂(CP-PLeu、CP-PVal和CP-PIle)处理的细胞荧光信号更强，表明BCAA修饰促进了更强的细胞积累。孵育2 h后，CPPLeu、CP-PVal和CP-PIle处理的细胞荧光强度随浓度的增加呈正增加趋势。cp - peg处理细胞的荧光强度在相对较低的浓度下趋于稳定，接近细胞摄取饱和。为了进一步研究CP-PLeu、CP-PVal和CP-PIle的高效细胞积累特性，将具有红色荧光的尼罗红染料加载到四种共轭聚合物(NR@CPPLeu、NR@CP-PVal、NR@CP-PIle和NR@CP-PEG)中，调整荧光强度，并与4T1细胞孵育。正如预期的那样，孵育2小时后的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)图像显示，与NR@CPPEG-treated细胞相比，NR@CPPLeu、NR@CP-PVal和NR@CP-PIle处理的细胞细胞质中的红色荧光信号更强。随后，对细胞摄取动力学进行监测，以进一步阐明bcaas修饰的共轭聚合物在4T1细胞中的有效积累。尼罗河红染料，显示红色荧光，被加载到两个共轭聚合物(NR@CP-PLeu, NR@CP-PEG)与调整一致的荧光强度直接比较。结果显示，在4小时内，NR@CP-PLeu-treated细胞在每个时间点(0.5、1、2和4小时)的红色荧光强度明显高于NR@CP-PEG-treated细胞。
为了探讨ROS对肿瘤拮抗的抑制作用，我们检测了4个治疗组中其他肿瘤代谢标志物的变化(1组为对照组;2组采用CP-PLeu +近红外激光照射，即mPTT组;第三组采用CP-PLeu和Xe灯照射，即PDT组;第4组采用CP-PLeu联合近红外激光/氙灯照射(PDT/mPTT组)。利用DCFH-DA法可视化CP-PLeu光动力效应产生的ROS。PDT作用的第3组和第4组细胞出现了明显的绿色荧光，表明CP-PLeu的光动力作用产生了ROS。近红外激光照射引起的热疗可以影响细胞内氧化还原平衡，可能改变细胞代谢过程并增加ROS的产生。因此，在接受光热处理的第2组中检测到适度的ROS信号。重要的是，与第3组相比，第4组显示出更高的ROS信号，这表明PDT/mPTT在ROS产生中的协同作用。
药物动力学特征
为了评估CP-PLeu的药代动力学和肿瘤摄取效率，我们在NIR-II区域对4t1荷瘤小鼠(原位植入乳腺垫)进行了全身成像。静脉注射浓度为2mg mL−1的CP-PLeu后，在肿瘤内逐渐积累，在12h内达到最大浓度，并表现出典型的肝脏代谢。相比之下，CP-PEG (5mg mL−1)需要两倍的时间(24h)才能达到最大积累。CP-PLeu表现出比CP-PEG更特异性的肿瘤识别，可能是由于悬垂的亮氨酸部分促进了4T1肿瘤细胞通过LAT更有效地摄取。这种特殊的识别机制优于通常负责NP在肿瘤中积累的增强渗透性和保留效应。此外，CP-PLeu在肿瘤内的分布比CP-PEG更好，这可以从各自最大时间点肿瘤部位的荧光分布看出。这表明用BCAAs修饰的光敏剂可以实现快速均匀的肿瘤积累，潜在地降低了用于mPTT的近红外激光所需的照射功率。
非创伤治疗在体内
受CP-PLeu良好的积累和代谢作用启发，我们进一步通过PDT/mPTT协同过程评估其抗肿瘤功效。采用四组小鼠进行比较评价:1组(对照组)给予PBS, 2组给予CP-PLeu加1064 nm激光照射PTT, 3组给予CP-PLeu加Xe灯照射PDT, 4组给予CP-PLeu加Xe灯和1064 nm激光照射PDT/mPTT协同作用。静脉注射CP-PLeu (2mg mL−1)12小时后，分别进行照射，进行光疗。对于mPTT治疗，监测肿瘤区域温度，并通过调节近红外照射强度在43°C下维持10分钟。5个治疗周期后，所有小鼠保留，第20天处死，观察肿瘤生长情况。在治疗过程中每三天监测并记录肿瘤体积。1组和2组肿瘤的生长未受抑制，肿瘤体积逐渐增大，表明mPTT过程失败。然而，在PDT参与的第3组和第4组中，肿瘤生长受到抑制，并在5个治疗周期后继续下降。在牺牲小鼠后，收集肿瘤并称重。第4组的肿瘤明显更小，抑制率最高，达到95.1%，包括肿瘤完全治愈的病例，说明PDT和mPTT的协同作用使得治疗效果更佳。随后对收集的肿瘤进行组织学检查，采用苏木精和伊红染色(H&E)观察损伤的肿瘤细胞。第4组切除的肿瘤组织中可见清晰明确的破坏，而第1组肿瘤组织保留了规则的细胞形态，细胞核完整。通过DNA损伤和细胞凋亡免疫染色实验评估治疗后肿瘤部位。用TUNEL法观察肿瘤部位的细胞凋亡，观察断裂的DNA链。在3组和4组中，来自断裂DNA链的显著绿色荧光占优势，而来自未受损DNA链的蓝色荧光相应减少，表明PDT/mPTT对肿瘤细胞有致死作用。
总结
我们开发了一种仿生光敏剂构建策略，通过亮氨酸修饰其形成仿生纳米团簇，旨在实现肿瘤中快速均匀的积累。与正常细胞相比，肿瘤细胞由于代谢更加旺盛，对氨基酸的需求量更高，尤其是支链氨基酸。我们设计的亮氨酸修饰共轭聚合物(CP-PLeu)在乳腺癌细胞中具有良好的积累效率，并且在原位植入的乳腺肿瘤中分布均匀。这有助于在mPTT过程中治疗温度的均匀分布。此外，CP-PLeu通过光动力效应逆转肿瘤的耐热性和生理修复机制，从而抑制肿瘤的拮抗作用。这种mPTT治疗效果的优化有助于乳腺癌的无创性治疗过程。该方法提供了一种独特的基于肿瘤特定代谢特征的光敏剂构建策略，逆转肿瘤的热阻，优化mPTT的疗效，有助于扩大无伤性PTT的应用范围，进一步提高其临床可行性。
参考文献
A Bioinspired Photosensitizer Performs Tumor Thermoresistance Reversion to Optimize the Atraumatic Mild-Hyperthermia Photothermal Therapy for Breast Cancer， Jie Li, Die Yang, Wentao Lyu, Yan Yuan, Xiao Han, Weiqing Yue, Jian Jiang, Yingping Xiao,Zhijie Fang, Xiaomei Lu,* Wen Wang,* and Wei Huang*，Adv. Mater. 2024, 36, 2405890，https://doi.org/10.1002/adma.202405890
