内容提要
近年来，高效有机光敏剂(ps)的设计和开发取得了新的进展，特别是在第二近红外(NIR-II, 1000-1700 nm)区域的荧光成像导航。然而，由于缺乏高性能的NIR响应有机材料和靶向递送，只有少数具有高效氧不依赖能力的NIR-II发射有机PSs。本文报道了一种具有仿生工程的NIR-II发射有机纳米药物，用于胰腺肿瘤的高性能NIR-II成像和靶向多重光疗。设计了a -d - a型共轭小分子TPC并用于制备水分散纳米粒子，该纳米粒子在808 nm光照射下具有高效的I型和II型光动力性能，光热转化率高达57%，NIR-II发光量子产率高达9.8%。利用胰腺癌细胞膜伪装，仿生TPC纳米药物实现了全身血管和肿瘤的高分辨率、靶向生物成像。808 nm光照射下的抗肿瘤实验表明，仿生TPC纳米药物具有较高的胰腺肿瘤消除效率和良好的生物安全性。这项工作展示了一种NIR-II发射的多功能纳米药物，具有增强的肿瘤靶向性，可用于高分辨率NIR-II生物成像和优越的光疗，为靶向和高性能治疗学的发展提供了可行的思路。
结果与讨论
材料合成、NPs制备及特性
通过经典的Knoevenagel缩合反应合成了A- d -A构型的共轭小分子TPC，产率高达88%。理论计算TPC的最高已占据分子轨道(HOMO)和最低未占据分子轨道(LUMO)所示。HOMO主要定位在给体部分(TPB 50)， LUMO定位在受体部分(2-(4-氧环戊[c]噻吩-6-乙基)丙二腈)，能隙小(Eg = 1.98 eV)，表明具有良好的D-A相互作用，支持强的分子内电荷转移(ICT)。由于TPC在四氢呋喃(THF)中的强ICT特性，其吸收峰在710 nm处发生位移，摩尔吸收系数为1.4×105 L mol−1 cm−1。在808 nm光照射下，TPC在NIR-II成像仪下显示出明亮的NIRII荧光。这些结果表明，TPC是一个很好的候选者，因为它可能用于NIR-II生物医学应用。
为了提高适用性，我们采用了先前使用的纳米沉淀法来制备水分散的TPC NPs。通过动态光散射(DLS)测量了TPC NPs的尺寸，结果表明TPC NPs的尺寸为≈6.4 nm。透射电子显微镜(TEM)进一步证实了TPC NPs的小尺寸和均匀球形。观察到TPC NPs的负zeta电位(- 53.1 mV)，并且NPs在12天的储存中表现出良好的稳定性。利用紫外-可见-近红外吸收光谱和荧光光谱对TPC NPs的光学性能进行了表征。TPC NPs的最大吸光度峰在900 nm以上大量展宽并延伸。TPC NPs在773 nm处的吸收最大值比自由TPC在710 nm处的吸收最大值红移63 nm。在808 nm激光的激发下，TPC NPs的荧光发射表现出明显的NIR-II信号，同时也表现出明亮和浓度相关的特征 。以IR26(在1,2-二氯乙烷中PLQY为0.5%)为标准参比，测得TPC NPs的荧光QY为9.8%，具有较高的NIR-II效率。
我们研究了PDT对TPC NPs的影响和不同ROS的产生。在808 nm激光辐射(0.33 W cm−2)下，用常见的ROS指示剂2′，7′-二氯二氢双乙酸荧光素(DCFH-DA)评价TPC NPs的总ROS生成，以美国食品药品监督管理局批准的光敏剂吲哚菁绿(ICG)作为对照。非荧光DCFHDA与ROS反应后转化为绿色荧光DCF。如图1F和图S10(辅助信息)所示，在808 nm激发下，TPC NPs在525 nm处诱导DCF的荧光增强明显，而在相同光照射下，DCFH未见明显变化。值得注意的是，TPC NPs在照射后5 min内对DCF的荧光增强达到98倍，在相同浓度下，其荧光增强性能比ICG高29倍，表明TPC NPs具有良好的ROS生成能力。然后，用特异性荧光探针进一步评估TPC NPs的I型和II型ROS能力。为了评估I型ROS的生成能力，我们分别用羟基荧光素(HPF)和二氢霍达明123 (DHR123)探针检测羟基自由基(•OH)和超氧阴离子自由基(O2•)。在808 nm光照射下，HPF和DHR123的荧光被TPC NPs明显激活。相比之下，ICG仅轻微触发HPF探针的荧光增强。此外，我们使用单线态氧传感器绿色(SOSG)探针作为特定的单线态氧(1O2)指示剂，发现TPC NPs也能增强SOSG的荧光，而ICG则不能(图1I;图S12，支持信息)。这些结果表明，TPC NPs是一种高效的808 nm激发PDT试剂，具有高性能的I型和II型ROS生成。
在808 nm光的照射下，进一步研究了TPC NPs的光热性能。在808 nm (1.0 W cm−2)光照射10 min内，不同浓度的TPC NPs的温度迅速升高，在相同条件下，单独水的温度升高可以忽略不计，而25 μg mL−1的TPC NPs在光照射10 min后达到≈73℃。此外，TPC NPs的功率依赖性光热性能也得到了证实。此外，通过10 min的加热(激光开)和冷却(激光关)10次循环来评估TPC NPs的光热稳定性。经过tencycle实验后，ICG几乎完全丧失了光热转换能力。然而，在相同的条件下，TPC NPs保持了不可减弱的光热转换能力，表明TPC NPs具有良好的光热稳定性。根据先前报道的方法，确定TPC NPs的光热转换效率为56.8%，与先前报道的光热疗法(PTT)药物相当。在808 nm激光激发下，TPC NPs可以同时实现NIR-II荧光、I型和II型PDT以及PTT效应，显示出多功能的近红外性能。
体外抗肿瘤疗效
高效的内吞作用和肿瘤靶向是高效抗肿瘤治疗的关键。为了实现上述能力，通过膜挤压制备将小鼠胰腺癌细胞的细胞膜(Panc02)涂覆在TPC NPs表面，从而得到伪装的NPs (TPC CNPs)。采用荧光素标记的DSPE-PEG2000制备TPC NPs和TPC CNPs，通过共聚焦显微镜实时观察细胞内吞过程。蛋白质凝胶电泳证明了TPC CNPs的高效细胞膜包被。TPC CNPs的DLS、TEM、zeta电位、光热转换和稳定性进一步证实了其有效的细胞膜涂层能力和不变的光热性能(图S17-S20, support Information)。在相同条件下，TPC CNPs比TPC NPs表现出更有效的细胞内吞作用，这表明Panc-02细胞膜表面涂层可以增强TPC NPs的细胞摄取。因此，使用TPC CNPs进一步测试其抗肿瘤作用。通过经典的MTT法测试了TPC CNPs的细胞生物相容性，结果表明，在孵育24小时后，TPC CNPs对Panc-02细胞、人非小细胞肺癌细胞(A549)和小鼠成骨前MC3T3-E1细胞(正常细胞)具有可忽略不计的暗细胞毒性。然而，在0.75 W cm−2的808 nm光照射下，相同浓度的TPC CNPs对Panc-02和A549细胞有明显的杀伤作用，20 μg mL−1 TPC CNPs处理的两种癌细胞的细胞存活率均降至10%以下，显示出其抗肿瘤作用。值得注意的是，相同浓度的TPC CNPs在0.33 W cm−2的808 nm光照射下对Panc-02和A549细胞造成明显的癌细胞死亡。这可能是由于低功率808 nm光照射下的高效PDT，对PTT性能的影响可以忽略不计(图S13，支持信息)。为了进一步研究PDT在活细胞中的效率，我们使用细胞内ROS荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS的生成。在0.33 W cm−2的808 nm光照射下，Panc-02细胞内的绿色荧光在0 ~ 20 μg mL−1的浓度范围内呈现出典型的NP浓度依赖性增强，表明TPC CNPs通过808 nm光激发的PDT效应高效生成ROS。此外，活细胞/死细胞染色证实了808 nm光照射下癌细胞的消融效率。流式细胞术分析证实，TPC CNPs联合808 nm光照射可有效诱导细胞凋亡和死亡。这些结果表明，在808 nm光照射下，表面包被肿瘤细胞膜的TPC CNPs表现出增强的内吞作用和有效的肿瘤细胞光消融。
体内NIR-II全身血管造影
为了证明TPC CNPs的NIR-II荧光成像性能，通过静脉注射TPC CNPs观察全身血管，并通过NIR-II成像系统观察。记录了在1000 ~ 1400 nm范围内经过各种长通(LP)滤波器的NIR-II荧光信号，以研究NIR-II窗口长波长的高分辨率成像。，经过不同LP滤波后，在所有NIR-II图像中都能看到小鼠血管。值得注意的是，当LP滤光片的波长从1000 nm增加到1400 nm时，图像对比度显著提高，背景干扰明显减少，这得益于NIR-II窗口中TPC CNPs的高亮度。此外，通过对荧光信号的高斯拟合，分析了黄线标记的后腿特定血管的横截面强度分布。对于1000nm、1100nm、1200nm、1300nm和1400nm的LP滤波器，血管的半最大值全宽度(FWHM)值分别为0.62、0.57、0.46、0.40和0.34 mm，与最近的报道相似。随着LP滤波器波长的增加，信噪比(SNR)增大。特别是，与其他滤波器相比，1400 nm LP滤波器的信噪比最高，达到7.19，表明TPC CNPs在长波长区域具有巨大的高分辨率NIR-II成像潜力。
体内成像引导肿瘤光疗
在体内，NIR-II窗口成像进一步用于动态可视化TPC CNPs的体内递送。通过皮下注射Panc-02肿瘤细胞建立裸鼠肿瘤模型。当实体瘤体积达到50-100 mm3时，静脉给药TPC NPs和TPC CNPs，并通过NIR-II成像仪观察。注射NPs或CNPs后，肿瘤内可见明显的荧光信号。NIR-II荧光在肿瘤部位的信号随注射后时间的增加先升高后降低，在注射后6 h达到最高强度。值得注意的是，在相同条件下，TPC CNPs比未涂膜的TPC NPs显示出更大的NIRII荧光强度，表明涂膜的TPC CNPs具有增强的肿瘤靶向积累。值得注意的是，NPs的荧光信号在全身和肿瘤部位缓慢下降，表明TPC CNPs被代谢。此外，NIR-II图像显示，TPC CNPs在注射后6小时在肿瘤中具有最高的荧光强度，这是后续光疗的最佳选择。此外，器官分布的NIR-II荧光图像显示信号主要分布在肝脏和肿瘤组织中，表明TPC CNPs在肿瘤部位有积累。
由于TPC CNPs在体外具有良好的光疗效果和在实体瘤中的高效蓄积，我们在Panc-02荷瘤裸鼠身上评价了这些材料的体内光热治疗效果。当肿瘤体积达到50 ~ 100 mm3时，将Panc-02荷瘤小鼠随机分为5组，每组4只:PBS、PBS加0.75 W cm−2光(PBS+0.75 l)、TPC CNPs (CNPs)、TPC CNPs加0.33 W cm−2光(CNPs+0.33 l)、TPC CNPs加0.75 W cm−2光(CNPs+0.75 l)。在注射后6小时，将PBS或CNPs静脉注射到小鼠体内，然后进行808 nm光照射(0.33或0.75 W cm−2)10分钟。在照射期间，通过红外相机或热像仪对肿瘤部位的温度变化进行成像。如图4B、C所示，pbs处理小鼠在光照5分钟后，肿瘤温度没有明显升高。然而，在相同条件下，CNPs+0.33L和CNPs+0.75 L组小鼠的肿瘤温度分别迅速达到≈44.2和55.4℃。这些结果与TPC CNPs的体外光热性能一致。在治疗后21天内，五组间几乎无明显差异。在21天的治疗中，CNPs+0.75L消除了肿瘤，没有引起肿瘤复发。然而，CNPs+0.33L在治疗8天内抑制肿瘤生长并重新出现，说明低功率光照射不能消除肿瘤复发风险。相比之下，单独使用PBS+0.75L或CNPs治疗的小鼠肿瘤的大小和重量与PBS组相似，这表明激光照射或单独使用CNP都不能单独达到抗癌效果。在21天的治疗期间，CNPs+0.75L组表现出有效的肿瘤消除，没有任何可观察到的复发。为了进一步证明808 nm光照射对TPC CNPs的效果，我们对肿瘤活检组织进行苏木精和伊红(H&E)染色、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫荧光染色和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP nick end labeling (TUNEL)检测，结果如图4H所示。显然，与PBS、PBS+0.75L和CNPs组相比，CNPs+0.75L组的肿瘤切片显示出恶性细胞的高效凋亡，细胞核高度碎片化，PCNA信号缺失，TUNEL信号强烈，表明TPC CNPs的光治疗作用可引发肿瘤凋亡和死亡。
总结
由癌细胞膜组成的多功能共轭小分子纳米颗粒(NPs)作为NIR-II发射纳米平台被开发用于高性能肿瘤治疗。在808 nm光照射下，TPC NPs可以通过I型和II型PDT途径产生多种类型的ROS，具有高达57%的光热转换效率和超高的稳定性。受益于其同源靶向性能，TPC CNPs被胰腺癌细胞膜伪装，在体内表现出高效的细胞摄取和增强的肿瘤靶向性，而对光学特性的影响不显著。体内实验表明，TPC CNPs是高分辨率NIR-II荧光成像和成像引导癌症光疗的良好探针。肿瘤治疗结果表明，TPC CNPs能有效消除胰腺癌，无任何副作用。这项研究提供了一种多功能的NIR-II发射小分子光敏剂，具有增强的肿瘤靶向性，用于高性能的肿瘤光诊断。
参考文献
A NIR-II-Emissive Organic Nanomedicine with Biomimetic Engineering for High-Contrast Targeted Bioimaging and Multiple Phototherapies of Pancreatic Tumors Yiwei Wang, Jie Zhang, Yu Wang,* Jie Yu, Yijian Gao, Yuliang Yang, Xiliang Li, Hongcheng Wang,* and Shengliang Li*，Adv. Funct. Mater. 2024, 2406483,https://doi.org/10.1002/adfm.202406483
