行业文献

内容提要

   自旋轨道电荷转移系统间交叉(SOCT-ISC)光物理过程显示出构建用于肿瘤光动力治疗(PDT)的无重原子光敏剂(PSs)的巨大潜力。然而，对于迄今为止报道的几乎所有此类PSs, SOCT-ISC是由受体激发的光诱导电子转移(a-PeT)驱动的。本研究首次利用供体激发光诱导电子转移(d-PeT)驱动的SOCT-ISC机制，直接将缺电子的n -烷基喹啉单元(作为电子受体)安装在近红外(NIR)二苯基体发色团(作为电子供体)的中间位置，构建了用于肿瘤PDT的重原子无PSs。在低极性环境中，PSs以单体形式存在，通过SOCT-ISC通过d- pet驱动的三重态激发态居群促进单线态氧(¹O₂) (II型)的产生，而在水环境中，它们以纳米聚集体形式存在，通过d- pet驱动的离域电荷分离态的形成诱导超氧化物(O₂^−•)和羟基自由基(HO•)(I型)的产生。在近红外光照射下，PSs可以迅速内化到癌细胞中，并诱导细胞内同时产生O₂、O₂^−•和HO•，使PSs具有极好的光毒作用，无论在常氧或缺氧条件下，其IC50值都高达亚微摩尔水平。基于PSs平台，研制了肿瘤靶向PSs，并在体外和体内验证了其在近红外光照射下杀伤癌细胞和消融肿瘤而不损伤正常细胞/组织的能力。

结果与讨论

BDP-Q1/BDP-Q2在单体和纳米聚集体中的光物理性质

   我们以喹啉-4-甲醛1和2,4-二甲基吡咯为原料，采用标准合成方法合成了间喹啉-4-酰基体二吡啶2，采用2与4-甲氧基苯甲醛的Knoevenagel缩合法合成了间喹啉-4-酰基体二吡啶3，采用3与碘甲烷和碘乙醇的n-烷基化法分别合成了BDP-Q1和BDP-Q2。此外，为了评估BDP-Q1和BDP-Q2生成O₂^•−的能力，我们还合成了生物素功能化的苯并噻嗪ENBS-B作为对照PSs，即2018年报道的第一代特异性I型增敏剂。我们首先研究了它们在甲苯、DMSO和PBS (10 mM, pH = 7.4)中的光物理性质。BDP-Q1和BDP-Q2在甲苯和DMSO中表现出相似的吸收谱，吸收峰在~ 650 nm处，这可以归因于它们的单体吸收。然而，在PBS (10 mM, pH = 7.4)中，两种化合物都表现出红移和明显变宽的吸收带，吸收强度大大降低，这与甲苯和DMSO不同，表明纳米聚集体的形成。47,48 BDPQ1和BDP-Q2的纳米聚集体的形成可以通过动态光散射(DLS)分析揭示，并通过透射电子显微镜(TEM)进一步观察，平均粒径分别为110和70 nm。BDP-Q1和BDP-Q2纳米聚集体的Zeta电位分别为11和3.2 mV，表明它们在水溶液中具有良好的分散稳定性。随后，我们测试了这两种化合物的荧光光谱。结果发现，在甲苯中，与合成前体间喹啉- 4-酰基二苯基BodIpy 3 (Φ = 0.42)的强荧光相比，BDP-Q1和BDP-Q2的荧光强度明显降低(Φ = 0.15和0.24)，而在高极性DMSO中，BDP-Q1和BDP-Q2的荧光强度更低(Φ = 0.04和0.06)，这有力地支持了它们单体形态中d- pet诱导的荧光猝灭的发生。然而，在PBS中，这两种化合物主要是由于聚集引起的猝灭(ACQ)而非荧光。为了探究d- pet诱导的猝灭荧光的非辐射衰变，在660 nm高功率激光(1 W cm⁻²)照射下，测试了BDP-Q1和BDP-Q2在不同溶剂中的光热效应，两种染料在不同溶剂中的光热转换效率(η)顺序为DMSO >甲苯>水，表明d- pet诱导的非辐射衰变在DMSO中比在甲苯中更有效，从而合理地解释了它们在DMSO中比在甲苯中更低的荧光量子产率。然而，由于水中纳米聚集体的形成在一定程度上限制了非辐射热衰变，其光热转换效率明显低于DMSO和甲苯。

通过I型和II型机制产生的光诱导ROS

   我们测试了BDP-Q1和BDP-Q2在空气饱和甲苯(低极性)和二甲基亚砜(高极性)溶液中分别产生O₂的能力，在660 nm LED光照射下(5 mW cm^-2)， 1,3-二苯基苯并异呋喃(DPBF)作为¹O2清除剂，DPBF/BDP-Q1或DPBF/BDP-Q2的甲苯溶液光照射后，在416 nm处DPBF吸光度快速下降。因此，这两种化合物都可以作为II型PSs促进大量¹O₂的产生，这与我们之前的推测一致，也表明了d-PeT策略在soct - Isco -based PSs工程中的合理性。根据衰减曲线的线性关系，计算出BDP-Q1和BDP-Q2的¹O2量子产率(ΦΔ)分别为0.17和0.10相比之下，在DMSO中，它们完全失去了生成O₂的能力，这证实了d- pet诱导的CSS状态在高极性溶剂中的强稳定性有效地促进了它的非辐射衰变到S0状态，而不是居族到活性T1状态。此外，我们评估了BDP-Q1和BDP-Q2在水中形成纳米聚集体的能力，使用水溶性9,10-蒽二丙酸(ABDA)作为¹O₂清除剂53然而，在本例中，我们没有观察到它们的水溶液在各自的光照射下产生¹O₂，从ABDA的吸收光谱变化可以忽略不计。结果表明，BDP-Q1(或BDP-Q2)纳米聚集体与周围O₂之间不通过II型机制发生能量传递。相反，我们分别使用二氢膦胺123 (DHR123，一种特定的荧光O₂^−•探针)和羟基苯基荧光素(HPF，一种特定的荧光HO•探针)53测试了它们的纳米聚集体在水中产生O₂^−•和HO•的能力。令我们高兴的是，在水中光照射它们的纳米聚集体显著提高了DHR123和HPF的荧光强度，这表明它们在水中形成的纳米聚集体通过以电子转移为特征的I型机制有效地促进了O₂^−•和HO•的生成。BDP-Q1或BDP-Q2的DMSO溶液，当它们以单体形式存在时，光照射不会产生O₂^−•，这一事实也支持了这一推测。就水体中O₂^−•或HO•的生成而言，BDP-Q2优于BDP-Q1，这与它们在甲苯中生成O₂的能力顺序相反。此外，我们还评估了ENBS-B的O₂ ^-•生成能力，即第一代I型敏化剂在光照射下产生O₂^-•，在其他相同的条件下(图S7)。结果表明，BDP-Q1或BDP-Q2的纳米聚集体确实比ENBS-B具有更强的生成O₂^−•的能力，DHR123对前者的荧光关闭响应明显更大。此外，我们使用商业ROS探针2,7-二氯二氢荧光素(DCFH)分别评估了水中BDP-Q1和BDP-Q2的总ROS生成，并将结果与亚甲基蓝(MB，一种商业PSs)和ENBS-B在其他相同条件下的结果进行了比较。这些PSs在水中生成ros的能力依次为BDP-Q2 > BDP-Q1 > MB > ENBS-B。为了更好地模拟生理环境，我们还使用DCFH测试了BDP-Q1和BDP-Q2在细胞培养基DMEM中的ROS生成，发现在这种条件下，BDP-Q2仍然表现出比BDP-Q1更强的ROS生成能力。综上所述，这些结果表明，BDP-Q1和BDP-Q2在低极性环境中可以作为II型PSs产生¹O₂，而在水溶液中可以作为I型PSs产生O₂^−•和HO•。这是非常需要的，因为基于soct - Iscs的PSs通常易受水的影响，并且经常因其高极性CSS状态的非辐射热失活而在溶剂中失去光敏性。

常氧和缺氧条件下BDP-Q1和BDP-Q2的体外PDT评价

   受上述结果的鼓舞，我们随后在共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)下，利用单线态氧传感器绿色(SOSG，与¹O₂反应时发出绿色荧光)作为特异性¹O₂指示物55，评估了BDP-Q1和BDP-Q2在人肺癌A549细胞中产生¹O₂的能力。在660 nm LED光(20 mW cm⁻²,20 mIn)连续照射下，负载SOSG/BDP-Q1或SOSG/BDP-Q2的A549细胞显示出明亮的绿色荧光，表明细胞内产生了大量的¹O₂;此外，当负载SOSG/BDP-Q1-或SOSG/ bdp - q2的A549细胞与¹O₂清除剂NaN3 (50 μM)56预孵育后，在660 nm LED光照射下，细胞内的绿色荧光几乎消失，证实光照射确实产生了细胞内的¹O₂。接下来，我们通过双氢乙啶(DHE，一种特殊的荧光O₂^−•探针，在O₂^−•氧化后发出红色荧光)53染色试验，评估了BDP-Q1和BDP-Q2在A549细胞中产生O₂^−•的能力。在660 nm LED光照射下，细胞内红色荧光明显增强，说明负载BDP-Q1-或bdp - q2的A549细胞在光照射下也产生了细胞内O₂^−•。随后，我们使用特异性荧光HO•探针HPF评估了BDP-Q1和BDP-Q2在A549细胞中产生HO•的能力，该探针在与HO•反应时发出绿色荧光。在660 nm的LED光照射下，可以清楚地观察到细胞内强烈的绿色荧光，表明负载BDP-Q1-或bdp - q2的A549细胞在光照射下也同时产生了细胞内HO•。此外，我们还证实，在660nm LED光照射下，负载上述任一ROS探针(SOSG或DHE或HPF)的A549细胞均未诱导荧光增强，从而排除了假阳性。总之，光照下细胞内同时产生¹O₂、O₂^−•和HO•强烈表明，细胞内ROS的产生是BDP-Q1或BDPQ2的单体和纳米聚集体的结果。此外，细胞共定位实验显示BDPQ1和BDP-Q2主要位于线粒体中，少量位于溶酶体中。线粒体中优越的定位可能归因于它们带正电的n -烷基喹啉单元，由于线粒体膜电位高度负，该单元引导它们进入线粒体pdt诱导的线粒体去极化是早期凋亡细胞的一个特征，用商用线粒体膜电位探针JC-1(红色荧光，高膜电位;连续光照射后，JC-1细胞内可见明显的绿色荧光，与未光照射对照组细胞内可见的红色荧光不同。为了直观地揭示BDP-Q1或BDP-Q2的细胞杀伤效率，我们使用钙黄蛋白AM(绿色荧光，活细胞)/PI(红色荧光，死细胞)进行活/死细胞染色试验，以可视化细胞活力如图所示，对照组(未经激光照射)显示出较强的钙黄素AM绿色荧光，说明BDP-Q1或BDP-Q2单独不诱导细胞死亡，暗毒性低，生物相容性好;相比之下，在660 nm LED光下暴露20分钟后，加载BDPQ1-或bdpq2的A549细胞几乎全部被杀死，细胞内PI的红色荧光强烈。综上所述，上述结果证实了近红外光照射BDP-Q1-或ACS应用材料与界面www.acsamI.org研究文章httPSs://doI.org/10.1021/acsamI.4c02175 ACS应用。板牙。界面XXXX、XXX、XXX−XXX kbdp - q2负载的A549细胞可以同时产生细胞内¹O₂、O₂^−•和HO•，导致线粒体去极化，导致细胞死亡。随后，我们分别在常氧和缺氧条件下通过MTT实验评估了BDP-Q1和BPD-Q2对A549细胞的PDT效果。光照射后，负载BDP-Q1-或bdp - q2的细胞在37℃下进一步孵育24 h，然后进行MTT实验。如图4F ~ 4I所示，无论是在常氧(21% O₂)还是缺氧(2% O₂)条件下，BDP-Q1和BPDQ2在1 ~ 12 μM的浓度范围内均表现出可以忽略不计的暗毒性，表明它们具有良好的生物相容性。当暴露于660 nm LED光(20 mW cm⁻²,20 mIn)下时，BDP-Q1和BDP-Q2以剂量依赖性的方式有效抑制细胞增殖，在常氧下IC50值分别高达0.45和0.39 μM。在低氧条件下，BDP-Q1和BDP-Q2对A549细胞仍表现出较高的光毒性，IC50值分别低至0.56 μM和0.49 μM。同时，我们对第一代特异性I型增敏剂ENBS-B 11在A549细胞中的PDT效果进行了评价，结果显示，在相同的条件下，PSs在常氧(21% O₂)和低氧(2% O₂)下也表现出较强的细胞杀伤能力，IC50值分别高达0.50 μM和0.64 μM。值得一提的是，当光照射时间从20分钟缩短到10分钟时，BDP-Q1/BDP-Q2的IC50值从0.45/0.39 μM增加到1.5/ 0.7 μM，进一步说明BDP-Q2的PDT效果比BDP-Q1更强。此外，我们在不同功率密度的660 nm激光下，评估了BDP-Q1和BDP-Q2(均为30 μM)在PBS中的光热效应。研究发现，10 mW cm⁻²的激光引起的温度升高可以忽略不计，而更高功率的激光源(50或100 mW cm⁻²)只使温度升高不到4℃。因此，光热效应应该在两种PSs杀死癌细胞中起次要作用。近红外光照射负载BDP-Q1-或bdp - q2的A549细胞通过产生¹O₂、O₂^−•和HO•诱导细胞毒性，导致线粒体去极化，促进细胞死亡，IC50值高达亚微摩尔水平。同时，这也表明BDP-Q1和BDP-Q2的细胞内存在形式可能包括单体和纳米聚集体，前者由细胞内较少极性和疏水区域稳定，后者由细胞内亲水区域稳定。

开发靶向PSs Glu-BDP-Q2用于肿瘤体内PDT治疗

   我们通过形成酯键将γ-谷氨酰基(GGT的可切割底物)共价安装到n -2-羟乙基柄上，制备了肿瘤靶向PSs glup - bdp - q2。众所周知，GGT在多种癌细胞的细胞膜表面过表达，催化谷胱甘肽γ -谷氨酰键的水解，介导细胞谷胱甘肽稳态，促进肿瘤的进展、侵袭和耐药因此，我们非常期待ggt催化Glu-BDP-Q2中γ-谷氨酰基的水解可以释放PSs BDP-Q2，然后将其内化到癌细胞中，从而在光照下特异性杀死癌细胞。我们先用Glu-BDP-Q2测试了它在不同溶剂中的吸收光谱。在DMSO中，Glu-BDP-Q2呈现出与BDP-Q2在DMSO中相似的尖锐吸收带，表明该化合物以单体形式存在于强极性溶剂中;然而，在甲苯中，它的吸收带变宽，吸光度降低，表明由于存在强亲水性的N-γ-谷氨酰基，它在极性较差的溶剂中溶解度低。与BDP-Q2类似，在PBS中，观察到Glu-BDP-Q2的吸收带红移、减小和变宽，表明可能形成纳米聚集体。测定了Glu-BDP-Q2在甲苯和DMSO中的荧光量子产率分别为0.19和0.09;然而，在PBS中，由于聚集诱导的猝灭，它是无荧光的，这与BDP-Q2中发现的相似。随后，我们评估了660 L LED光照射下Glu-BDP-Q2产生ROS的能力。虽然glue - bdpq2与BDP-Q2结构相似，但它在甲苯中不产生¹O2，在DMSO或MeCN中也是如此;此外，在这些有机溶剂中，也没有检测到总ROS，这可以从可忽略的DCFH响应中看出。Glu-BDP-Q2在甲苯中生成O₂能力的意外丧失令人困惑。考虑到BDP-Q1 (ΦΔ = 0.17)、BDP-Q2 (ΦΔ = 0.10)和Glu-BDP-Q2 (ΦΔ≈0)在甲苯中生成¹O2的能力逐渐下降，虽然确切的机制仍有待完全了解，但n -烷基的立体体积似乎在调节它们与O₂的反应生成¹O2中起作用;即n -烷基的空间体积越大，¹O₂的量子产率越低。此外，Glu-BDP-Q2在甲苯中的溶解度低，摩尔消光系数大大降低(比BDP-Q2低约7倍)，这也应该是其在溶剂中产生可忽略不计的¹O2的原因。进一步，我们发现在水溶液中，Glu-BDP-Q2仅诱导少量的O₂^−•和HO•，其产生总ROS的能力也很差。通过动态光散射(DLS)实验，我们也发现了glue - bdpq2在水中形成纳米聚集体，并且确定了其平均粒径为178 nm。然而，纳米聚集体的Zeta电位仅为0.43 mV，大大低于BDP-Q1或BDPQ2纳米聚集体，表明其在水溶液中的分散稳定性较差。根据观察，我们将Glu-BDP-Q2在水中产生O₂^−•和HO•的能力差归因于其丁基N-γ-谷氨酰基，导致其在光照射下产生O₂^−•或OH•的聚集模式无效。接下来，我们在PBS (10 mM, pH = 7.4，含10%甲醇)中测试了GGT不存在和存在时glul - bdp - q2的吸收光谱，以探测酶促反应。然而，由于存在相同的BodIpy核心，吸收光谱难以区分Glu-BDP-Q2及其反应产物BDP-Q2，这促使我们进一步进行HPLC-MS研究。Glu-BDP-Q2本身在37°C的HPLC检测中显示保留时间为6.76 mIn;GGT治疗20 mIn后，Glu-BDP-Q2的峰值大幅下降，在7.37 mIn出现了一个明显的新峰，根据MS数据可以明确为BDP-Q2。因此，Glu-BDP-Q2是GGT的有效底物。受此结果的鼓舞，我们在660 nm LED光下使用DCFH检测了Glu-BPD-Q2/GGT混合物的ROS生成，得到了与单独使用BPD-Q2相似的结果，表明酶促反应有效地释放了BPD-Q2，然后在光照射下原位形成纳米聚集体诱导O₂^−•和HO•的产生。我们使用MTT法评估了GluBDP-Q2在癌变A549细胞和正常RAW264.7细胞中的光细胞毒性。36 .在我们之前的报道中已经证实，癌变的A549细胞中GGT活性高，而正常的RAW264.7细胞中GGT活性低首先，将两种细胞分别与不同剂量的Glu-BDP-Q2在DMEM中孵育120 mIn，然后不加和加660 nm LED光(20 mW cm - 2, 20 mIn)，孵育24 h后进行MTT检测。如图5A所示，在1 ~ 12 μM的浓度范围内，无光照射时，Glu-BDP-Q2对A549细胞和RAW264.7细胞几乎没有细胞毒性。在连续光照射下，Glu-BDP-Q2对癌变的A549细胞有明显的诱导作用，IC50值高达0.44 μM，但对正常的RAW264.7细胞的诱导作用较弱(即使在2 μM浓度下，细胞存活率也>80%)。此外，光照射后，Glu-BDP-Q2引起的癌细胞死亡可被GGT抑制剂(GGsTop, 100 μM)极大地抑制，60这表明Glu-BDP-Q2对癌变A549细胞的高PDT效应在很大程度上依赖于定位于癌细胞膜表面的GGT活性，并通过去除Glu-BDP-Q2中的亲水性γ-谷氨酰基发挥作用，从而促进细胞摄取释放的BDP-Q2。Glu-BDP-Q2对正常RAW264.7细胞的PDT作用差，主要是由于其高度亲水的γ-谷氨酰基导致其细胞膜通透性差，以及正常细胞的GGT活性差，阻止了细胞膜通透性BDP-Q2的释放，从而保护细胞免受光损伤。显然，与正常细胞相比，Glu-BDP-Q2对癌细胞的PDT作用具有高度选择性。我们以BDP-Q2为对照，评估了GluBDP-Q2的体内PDT疗效。通过皮下注射A549细胞建立BALB/c小鼠A549荷瘤模型。当肿瘤体积达到约80 mm³时，进行体内PDT。老鼠被分成六组。瘤内注射Glu-BDP-Q2 (2 μM, 25 μL/50 mm³肿瘤)后，分别用660 nm LED光(100 mW cm⁻²,20 mIn)照射和不照射小鼠肿瘤区域(分别用Glu-BDP-Q2/lIght组和Glu-BDP-Q2组)。对于BDP-Q2，给出了相同的分配(分别表示为BDP-Q2/lIght组和BDP-Q2组)。另外，PBS经光照和不光照处理的小鼠也作为对照组(分别记为PBS/光照组和PBS组)。光照时间点选择在肿瘤注射Glu-BDP-Q2或BDP-Q2后30mIn，此时由于ggt催化BDP-Q2释放，肿瘤荧光强度最高;而正常组织注射Glu-BDP-Q2时，几乎看不到荧光。注射后15 d, Glu-BDPQ2/lIght组和BDP-Q2/lIght组肿瘤几乎消失，而对照组肿瘤生长迅速，表明其体内PDT效果良好。Glu-BDP-Q2可以被癌性A549细胞表面过表达的GGT有效催化，释放出活性PSs BDP-Q2, BDP-Q2渗透到细胞中，发挥活性PSs的作用。此外，PDT处理后，小鼠体重略有增加，说明这两种PSs的全身细胞毒性可以忽略不计。苏木精和伊红(H&E)染色显示BDP-Q2/lIght组和Glu-BDP-Q2/lIght组细胞凋亡明显，而对照组未见广泛的细胞损伤。因此，Glu-BDP-Q2很有希望作为肿瘤特异性的PSs，对肿瘤进行有效的PDT治疗。为了证实Glu-BDP-Q2对正常组织的光损伤程度低或可忽略不计，我们进一步评估了其对小鼠正常组织的PDT作用，并与BDP-Q2进行了比较。为此，首先将PBS (25 μL)、Glu-BDP-Q2 (2 μM, 25 μL)和BDP-Q2 (2 μM, 25 μL)分别肌注于正常小鼠左后腿组织。30 mIn后，分别对左后腿组织进行660 nm LED光(100 mW cm ^{- 2}, 20 mIn)照射。24h后，取正常左后腿组织冷冻切片，厚度为10 μm，进行H&E染色。如图所示，在660 nm LED光照射后，BDP-Q2/lIght组可见明显的组织病理学损伤，而PBS和Glu-BDP-Q2/lIght组未见组织病理学异常，这有力说明Glu-BDP-Q2不会对健康组织造成非特异性光损伤，对肿瘤具有更高的PDT治疗精度。

总结

   本研究基于D-PeT策略，通过在二苯基体二苯基电子给体的介位上安装丁基纳烷基喹啉电子受体，得到了两个无重原子的近红外PSs，即BDP-Q1和BDP-Q2。在极性较低的有机溶剂中，BDP-Q1和BDP-Q2作为单体存在，通过SOCT-ISC驱动形成T1态，从而促进¹O₂的生成;而在极性较高的有机溶剂中，由于极性溶剂中D-PeT诱导的电荷分离态的强稳定性，它们的光敏性消失，有效地促进了其非辐射衰变到S0态，而不是通过SOCT-ISC迁移到T1态。然而，在水环境中，BDP-Q1和BDP-Q2都形成了纳米聚集体，通过d- pet驱动CSS1态形成离域电荷分离的CSS2态，有效促进了O₂^•−和HO•的产生。细胞活力实验表明，两种PSs均具有良好的光毒作用，在常氧和缺氧条件下均能有效抑制癌细胞增殖，IC50值高达亚微摩尔水平。此外，为了减少对正常组织的光损伤，我们在BDP-Q2平台上制备了肿瘤靶向的PSs Glu-BDP-Q2，并在体内和体外证明了其在近红外光照射下ggt催化活性PSs BDP-Q2的释放和对癌细胞/组织的特异性杀伤能力。总的来说，该研究不仅通过引入d-PeT策略扩大了基于soct - Iscs的PSs的设计范围，而且还提供了一种有效的方法，通过形成纳米聚集体，通过I型机制促进高细胞毒性O₂^•−和HO•的产生，从而提高这种PSs在高极性水中生成ros的能力。鉴于I型PSs的低氧依赖性以及BDP-Q2在其聚集形态下产生O₂^−•和HO•的能力较强，我们也希望利用PSs的增强渗透性和滞留性(EPR)效应来构建靶向肿瘤PDT的聚合物纳米颗粒。

参考文献

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