内容提要
近红外光敏剂是提高光动力治疗(PDT)深度的重要工具。然而，它们的低单线态氧(1O2)生成能力，表现为低的1O2量子产率，给PDT带来了巨大的挑战。为了克服这一挑战，用生物相容性的S (Scy7)和Se (Secy7)原子修饰七甲基菁。我们观察到Secy7在主吸收处红移至~840 nm，并具有超高效的1O2生成能力。Se原子和多甲基链之间强烈的分子内电荷转移效应的出现大大缩小了能隙(0.51 eV)， Se的重原子效应增强了自旋轨道耦合(1.44 cm−1)，两者都极大地提高了高三重态产率(61%)，这一状态决定了向O2的能量转移。因此，在低功率密度850 nm (5 mW cm−2)照射下，Secy7表现出优异的1O2生成能力，是吲哚菁绿的~24.5倍，IR780的~8.2倍，亚甲基蓝的~1.3倍。Secy7对埋在12毫米组织下的癌细胞表现出相当大的光毒性。将Secy7包埋在两亲性聚合物和卵磷脂中形成的纳米颗粒显示出有希望的抗肿瘤和抗肺转移效果，显示出推进深部组织PDT的显著潜力。
结果与讨论
合成及光化学性质
考虑到Cy7的近红外吸收能力和较大的摩尔消光系数(>105 M−1 cm−1)，我们选择Cy7作为近红外光响应PS的框架。设计并合成了4个Cy7衍生物。比较了cyy7和cyy7的吸收光谱，发现在Cy7框架中引入Se原子导致了吸收红移。同时，Secy7的最大Stokes荧光发射波长(λem)超过了其他衍生物，但强度最低。通常，荧光发射和ISC是相互竞争的能量耗散途径;因此，Secy7较低的荧光强度表明它可能通过ISC耗散更多的能量以跃迁到T1。我们使用1,3二苯基异苯并呋喃(DPBF)和1O2探针在850 nm照射下测试了合成衍生物的ROS生成能力。当照射850 nm时，含有Secy7和DPBF的溶液在1分钟内吸光度急剧下降(λabs = 415 nm)。值得注意的是，在这种情况下，激发功率密度仅为5 mW cm−2，表明Secy7在低功率密度近红外照射下具有高效的1O2生成能力。相比之下，在相同的实验条件下，含有DPBF和cy7、Icy7或Scy7的溶液没有明显的变化。之后，我们测试了在相同激发功率密度下808 nm辐照下衍生物生成1O2的能力。，与cy7、Icy7和Scy7相比，Secy7对DPBF的降解速度更快，这表明Secy7在808 nm处的吸光度低于其他花青素染料，但其产生1o2的能力更强。
胞摄取和亚细胞共定位
考虑到Secy7在低功率密度850 nm (5 mW cm−2)照射下能产生1O2，我们进行了体外实验。通常，PSs在细胞内的内化和亚细胞定位对于有效破坏PDT期间的正常生理平衡至关重要。使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)评估4T1细胞对Secy7的摄取。由于其固有的正电荷和相对较小的体积，Secy7在孵育30分钟内表现出显著的荧光，并随着时间的推移逐渐增强，表明Secy7在癌细胞内的高效内化。随后，使用几种市售的细胞器选择性跟踪器研究了Secy7的亚细胞分布，包括用于溶酶体的LysoTracker Green，用于细胞核的Hoechst 33342和用于线粒体的MitoTracker Green。Secy7主要定位于线粒体，观察到Secy7的红色荧光与MitoTracker Green的蓝色荧光有广泛的重叠(Pearson相关系数为0.96)。相反，在Secy7与溶酶体(0.16)和核追踪器(0.35)之间观察到较低的Pearson相关系数。值得注意的是，PSs产生的ROS粘附在线粒体上，直接破坏线粒体，增强了对癌细胞的杀伤作用。
体外光诱导细胞毒性评价
通常，细胞内的原位ROS生成对光诱导细胞破坏至关重要。为了验证这一点，我们使用2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为探针，初步评估了850 nm照射诱导的细胞内ROS生成。CLSM结果显示存在亮绿色荧光，表明在850 nm照射后，用Secy7孵育的4T1细胞产生ROS。随后，使用标准甲基噻唑四氮唑(MTT)法全面研究了Secy7对细胞的暗毒性。结果显示，即使在高达10mM的浓度下，Secy7在黑暗中处理12小时后，三种细胞系(4T1, MCF-7和A549)的存活率也没有降低。相反，在相同的实验条件下，与Icy7一起孵育会导致所有细胞系的活力严重下降。然而，尽管在MTT实验中，Scy7对4T1、MCF-7和A549细胞系的毒性可以忽略不计，但在Scy7孵育后，细胞形态发生了相当大的改变，这表明Scy7对正常生理过程的干扰是不可否认的。相反，用Secy7孵育不会破坏细胞形态。
因此，标准MTT试验和形态学表征均表明Secy7具有良好的生物相容性。在近红外照射(850 nm, 20 mW cm−2,10 min)后，Secy7根据其剂量有效抑制细胞增殖，当浓度为5mM时，癌细胞存活率降至25%以下。当照射时间延长至20 min时，细胞增殖进一步受到抑制，在相同浓度下，癌细胞存活率降至15%以下，即使浓度低至0.625mM，细胞破坏也很明显。此外，我们评估了Secy7对被12 mm组织覆盖的癌细胞的光毒性。结果显示，在850 nm (20 mW cm - 2和10 min)照射下，Secy7导致细胞活力显著降低。具体来说，在5mM照射后，有组织保护和没有组织保护的细胞存活率分别为26%和22%。因此，由于组织存在或不存在而导致的细胞存活率差异可以忽略不计，这表明Secy7在消融深埋于组织中的实体瘤方面具有显着的效力。当照射时间延长至20 min时，Secy7对癌细胞的光毒性进一步增强，缩小了组织存在(存活率为19%)和不存在(存活率为18%)所对应的细胞存活率差异。此外，为了直观地评估Secy7的光毒性作用，将4T1细胞与活细胞/死细胞探针、钙黄素- am和碘化propidium iodide (PI)一起孵育。值得注意的是，calcein-AM染色活细胞，发出绿色荧光，而PI染色死细胞，发出红色荧光。对照组、光处理组和Secy7处理组显示出强烈的绿色荧光，表明850 nm辐照和单独的Secy7均未诱导细胞死亡。相反，Secy7 + Light组呈现亮红色信号，表明850 nm照射与Secy7联合治疗可协同诱导癌细胞死亡。如前所述，亚细胞共定位实验揭示了Secy7在线粒体中的定位。因此，在各种处理后，使用JC-1指示剂仔细评估线粒体膜电位的变化。JC-1染色显示，在850 nm照射下，Secy7导致严重的线粒体去极化，其绿色荧光可见。相反，光或Secy7处理未显示膜电位的变化，如强红色荧光所示。JC-1显示，线粒体膜电位的降低表明PDT可能首先损害线粒体，从而损害肿瘤细胞。
体内肿瘤治疗
由于Scy7和Icy7在光物理性质和生物相容性方面表现不佳，因此Secy7被选为有希望进行体内抗癌研究的候选者。为了增强其在实体肿瘤内的积累，从而促进其在体内的应用，以DSPE-PEG2000和卵磷脂为载体，通过自组装制备了Secy7纳米颗粒(Secy7 NPs)。动态光散射(DLS)分析显示，Secy7 NPs的平均直径为~56.46 nm，透射电镜显示NPs呈球形。接下来，我们在7天内监测了Secy7 NPs的吸光度变化，以研究其稳定性，因为纳米颗粒的聚集或分解会导致吸光度的变化。在7天内观察到的吸光度变化可以忽略不计，表明Secy7 NPs具有良好的稳定性。首先，通过在BALB/c小鼠右后腿皮下注射4T1细胞，建立小鼠实体瘤模型。当肿瘤体积达到~100 mm3时，进行体内荧光和PDT治疗。为了评估Secy7 NPs在实体瘤内的积累情况，我们将皮下4T1肿瘤的BALB/c小鼠静脉注射10 nmol的Secy7 NPs，然后基于NIR-II小动物荧光成像进行体内荧光评估。
出乎意料的是，在静脉注射Secy7 NPs仅10分钟后，肿瘤部位的荧光变得明显，并且与邻近组织区分开来。随后进行实体瘤治疗，如图所示。将所有4t1荷瘤小鼠随机分为4组:Control组、Light组、Secy7 NPs组和Secy7 NPs + Light组。治疗15天后，对照组(未经任何治疗)肿瘤呈侵袭性生长，平均体积为~1200 mm3，比初始肿瘤体积增加了~15倍。此外，Light和Secy7 NPs均显示肿瘤生长增加了11倍以上，这表明无论是照射治疗还是单独使用Secy7治疗，抗肿瘤效果都较低。然而，用Secy7 NPs处理的组在850 nm照射后表现出相当大的肿瘤抑制作用，平均肿瘤体积缩小了约3倍，肿瘤抑制率增加到97.3%。此外，较低的平均肿瘤重量和肿瘤照片验证了Secy7的抗肿瘤功效。我们还基于苏木精和伊红(H&E)染色评估了不同治疗方法的治疗效果。secy7介导的光疗导致明显的组织坏死，而其他组没有表现出细胞损伤的迹象。为了证明Secy7对深部肿瘤的体内PDT潜能，在4t1荷瘤小鼠肿瘤部位照射时，用12mm的组织覆盖肿瘤。与对照组相比，PDT组肿瘤体积的生长明显受到抑制，尽管覆盖了12 mm的组织，但肿瘤抑制率提高到93.5%。此外，通过肿瘤照片、H&E染色和平均肿瘤重量证明了Secy7良好的深PDT电位。在给药期间监测小鼠体重，未见异常变化。
总结
通过在菁氨酸支架中加入Se来诱导ICT效应，我们合成了一个Se取代的近红外PS (Secy7)，在低功率密度850 nm照射(5 mW cm-2)下具有最高记录的<s:1>D(是ICG的~24.5倍，IR780的~8.2倍，MB的~1.3倍)。在Se和共轭多甲基链之间出现ICT，大大降低DEst，促进ISC，从而在重原子效应的协同作用下增加1O2的生成。此外，Secy7表现出相当高的能量耗散度(61%)和可观的kISC值，表明它更倾向于从S1过渡到T1，以消耗能量和产生1O2。与传统的I取代(Icy7)不同，Secy7不仅增强了1O2的生成，而且抑制了暗毒性。此外，由于Secy7在存在或缺乏组织保护的情况下表现出几乎一致的PDT性能，有效地抑制癌细胞活性，从而显示其治疗深埋肿瘤的潜力。此外，凭借其独特的对癌细胞的光毒性和良好的生物安全性，Secy7在荷瘤小鼠模型中显示出良好的抗肿瘤效率和抗转移作用。基于这些结果，我们认为Secy7代表了超高1O2量子产率的近红外ps的发展向前迈进了一步。
参考文献
Near-Infrared Heptamethine Cyanine Photosensitizers with Efficient Singlet Oxygen Generation for Anticancer Photodynamic Therapy，Wenkai Liu, Shan He, Xue Ma, Chengyuan Lv, Hua Gu, Jianfang Cao, Jianjun Du, Wen Sun, Jiangli Fan, and Xiaojun Peng，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202411802，https://doi.org/10.1002/anie.202411802
