内容提要
与传统疗法相比，光免疫疗法提供了精确的靶向癌症治疗，对健康组织的损伤最小，副作用减少，但其疗效可能受到浅光穿透和肿瘤耐药性的限制。在这里，一个受体-供体-受体(A-D-A)结构的纳米聚集体被开发了双重光疗，包括光动力疗法(PDT)和光热疗法(PTT)，由单一的近红外(NIR)光触发。得益于强大的分子内电荷转移(ICT)，A-D-A结构纳米聚集体具有广泛的吸收延伸到近红外区，有效抑制荧光，从而实现深度穿透和高效光热转换(67.94%)。合适的HOMO-LUMO分布有利于充分的系统间交叉(ISC)，将基态氧(3O2)转化为单线态氧(1O2)和超氧阴离子(·O2−)，并催化羟基自由基(·OH)的生成。增强的ICT和ISC效应使A-D-A结构纳米聚集体对宫颈癌具有有效的PTT和PDT，诱导有效的免疫原性细胞死亡。结合临床铝佐剂凝胶，开发了一种新的子宫颈癌光免疫治疗策略，并在原位和腹腔内转移子宫颈癌动物模型中证明了其对原发性和转移性肿瘤的显著抑制作用。无创治疗策略为临床早期和晚期宫颈癌的治疗提供了新的见解。
结果与讨论
材料的制备与表征
以9,14二氢- 4h -二噻唑[2′，3′:2,3;3′，2′:10,11]硝基咔唑(DTPC)为电子给体，2 -(6,7 -二氟-3-氧-2,3-二氢- 1h -环戊[b]萘-1 -乙基)丙二腈(NINCN-2F)为电子受体合成A-D-A分子DTPC- n2f。为了促进生物应用，我们使用文献记载的纳米沉淀法将DTPC-N2F合成为纳米颗粒，命名为DNPs。为了评估纳米颗粒形成前后DTPC-N2F光物理性质的变化，采用UV-vis-NIR光谱法测量其光吸收能力。DTPC-N2F在四氢呋喃(THF)溶液中的最大吸收峰在847 nm处，而在固体(膜)形态下，其最大吸收峰移至928 nm处。合成DNPs后，最大吸收峰移至949 nm。最大吸收峰发生红移的原因分析如下:已知小分子在薄膜或固体状态下通常表现出不同的聚集特性，包括H-聚集和j -聚集。这些A-D-A分子的聚集类型主要是j聚集，这导致了吸收红移。与溶液相比，DTPC-N2在薄膜或纳米颗粒状态下表现出强而有序的堆积，导致吸收光谱红移。吸收峰有较大的红移，表明制备成DNPs后，DTPC-N2F具有优异的近红外触发光疗能力。荧光光谱显示，溶解在THF中的DTPC-N2F表现出高荧光，而DNPs的荧光被猝灭。荧光猝灭说明dpcc - n2f制备成纳米颗粒(DNPs)后，使光能转化为热的能力最大化，并表现出优异的ISC能力，从而使PTT和PDT的效果最大化。瘤细胞膜表面的脂质成分和膜蛋白可以增强纳米颗粒的稳定性和抗肿瘤免疫活性。因此，我们利用小鼠宫颈癌U14细胞膜包被DNPs形成DNPs@CM。动态光散射(DLS)测试表明，DNPs和DNPs@CM都具有良好的分散性能，DNPs的最大水动力直径为164.2 nm, DNPs@CM的最大水动力直径为342 nm。Zeta电位测量显示，DNPs和DNPs@CM均具有显著的负表面电荷，最大表面电荷分别为- 40.4和- 33.8 mV，这有利于它们的胶体稳定性和更容易在肿瘤中吸附。此外，DNPs (25 μg mL−1)在Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium (DMEM)、水或PhosphateBuffered Saline (PBS)中溶解一周后，DNPs的外观和粒径几乎没有变化，表明DNPs具有良好的稳定性。代表性的透射电镜(TEM)图像显示，粒径约为150 nm的均匀球形DNPs和提取的细胞膜颗粒约为300 nm，并成功观察到膜包被纳米颗粒。用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯蓝对提取的膜表面蛋白进行染色后的不同条带显示也证实了U14肿瘤细胞膜在纳米颗粒上的成功包被。
DNPs的光热和光动力效应
该A-D-A结构的DTPC-N2F具有较强的ICT效应和较高的摩尔消光系数，具有窄带隙和较强的近红外光捕获能力。根据模拟Jablonski图，dpc - n2f和DSPE-PEG纳米颗粒作为DNPs共沉淀，导致荧光猝灭。在980 nm激光激发下，通过振动弛豫产生PTT效应。根据计算，ΔEST为0.55 eV，促进基态氧(3O2)转化为1O2，自由基·O2−和·OH的生成。在低功率(0.6 W cm−2)980 nm激光照射下，不同浓度的DNPs均表现出高效且快速的温度升高，这是红外热像仪记录的。随着辐照时间和辐照浓度的增加，溶液温度不断升高。当DNPs溶液浓度增加到50 μg mL−1时，激光照射12 min后温度达到55.3℃。在12.5 μ mL−1的较低浓度下，在相同条件下，溶液温度仍升高至48.5℃，足以诱导肿瘤细胞凋亡。相比之下，PBS溶液在光照12 min后，温度仅从27.1°C上升到30.1°C。用相同浓度的DNPs (50 μg mL−1)在不同功率水平下辐照;随着激光功率密度的增加，溶液温度升高，在1.0 W cm−2激光照射12 min后，溶液温度达到68.2℃。实验表明，DNPs在长波长光激发下具有有效的PTT效应。DNPs (50 μg mL−1)在PBS中进行5次热循环，每次用980 nm激光以0.6 W cm−2照射5分钟。每个周期的最高温度都超过50℃，在关闭激光器后，溶液的温度很快恢复到室温。根据文献，光热转换效率可达67.94%。为了进一步研究DNPs的稳定性，将不同浓度的DNPs(50、25、12.5 μg mL−1)用980 nm激光在1.0 W cm−2下照射30 min，并不断升高温度。照射前后溶液的UV-Vis-NIR吸收光谱显示，949 nm处的吸收峰没有明显变化，证实纳米颗粒具有优异的光稳定性。为了验证DNPs出色的I型和II型光动力效应，我们进行了各种体外实验来评估DNPs在光照射下产生ROS的能力。首先，以二苯基异苯并呋喃(diphenylisobenzofuran, DPBF)为探针，评估了980 nm激光照射下·O2−的生成能力。由于DNPs的有效ISC，当DNPs浓度从0增加到25 μg mL−1时，DPBF的吸收峰在3 min内下降了80%。即使在6.25 μg mL−1的较低浓度下，吸收峰也下降了60%。在相同DNPs浓度的980 nm激光照射下，不同功率设置下，DPBF吸收率也显著下降，并与时间和功率呈线性关系。接下来，使用单线态氧传感器绿色荧光探针(SOSG)检测1O2。在相同功率的980 nm激光照射下，SOSG的荧光强度随DNPs浓度的增加而增加;同样，在相同DNPs浓度下，SOSG的荧光强度随激光功率的增加而增加。随着时间的推移，这两种情况都呈现出线性关系，表明DNPs在980 nm激光照射下表现出出色的光动力学效应。此外，用3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(TMB)检测·OH的生成。当DNPs浓度为25 μg mL−1时，辐照10 min后，TMB的吸收峰增加约80%。在不同功率水平的980 nm激光照射下，TMB吸收峰也呈线性增加。
体外抗肿瘤特性
随后评估DNPs的体外生物相容性和抗肿瘤治疗作用。为确保DNPs治疗的安全性，将DNPs与U14和ncm460细胞孵育后，采用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)法对其毒性进行初步评估。即使在最高浓度为100 μg mL−1的情况下，DNPs在没有激光照射的情况下也不影响细胞活力，两种细胞的存活率均超过95%，显示出良好的生物相容性和生物医学应用潜力。用不同浓度的DNPs孵育的U14细胞在两种不同功率水平(1.0和0.6 W cm−2)的980 nm激光照射下照射4 min。在12.5、25和50 μg mL−1的浓度下，两种功率设置下的细胞存活率均小于20%。进一步分析使用钙黄素/PI细胞活力/细胞毒性测定试剂盒评估存在和不存在激光照射的活细胞和死细胞。DNPs+Light(L)和DNPs@CM+L组可见大量死亡细胞发出红色荧光，而PBS、PBS+L和DNPs组未见明显死亡细胞。使用ImageJ软件对细胞中的红色荧光进行定量分析，结果类似。这些结果表明，在一定浓度的980 nm激光照射下，DNPs具有良好的杀伤肿瘤细胞的能力。为了进一步研究DTPC-N2F强A-D-A结构对细胞的氧化损伤及其I型和II型PDT效应，我们使用2,7-二氯荧光素(DCFHDA)作为ROS探针，评估细胞内ROS水平。在荧光图像中，DNPs+L和DNPs@CM+L组细胞中观察到丰富的绿色荧光信号，而PBS、PBS+L和DNPs组细胞中绿色荧光微弱。使用ImageJ软件对三维图像进行定量分析，结果类似。此外，流式细胞术(FCM)定量细胞内ROS水平，结果显示DNPs+L和DNPs@CM+L组的ROS水平分别为55.36%和63.70%，显著高于其他组。ROS的产生机制是这样的，当光敏剂在特定波长的光照射下被激活时，能量耗散途径之一是通过ISC达到相对稳定的激发三重态(T1)。在ISC过程中，产生三重态激发的氧分子，或诱导电子转移，从而产生不同类型的ROS。计算得到的DNPs的ΔEST为0.55 eV，表明了良好的ISC能力。与先前发表的文献相比，DNPs表现出更高的ROS效率。尤其在DNPs@CM+L组中，DNPs由于被同源肿瘤细胞膜包裹，更容易被吞噬，表现出更强的诱导细胞内ROS产生的能力。
在PTT和PDT过程中，肿瘤细胞发生凋亡，线粒体膜电位的变化和核DNA损伤往往是细胞凋亡的指标。为了进一步探讨DNPs激光照射后PTT和PDT诱导细胞损伤的机制，我们首先采用JC-1染色观察线粒体膜电位的变化。在DNPs+L和DNPs@CM+L组中，由于线粒体膜电位降低，JC-1以单体形式存在于线粒体基质中，导致线粒体内红色荧光强度显著降低，细胞质内绿色荧光强度显著增加。而在PBS、PBS+L和DNPs组中，JC-1聚集在线粒体基质中，产生丰富的红色荧光和非常弱的绿色荧光。定量分析JC-1聚集体和JC-1单体的荧光强度也显示了类似的结果。H2AX免疫荧光染色检测不同处理组U14细胞DNA损伤情况。DNPs+L组和DNPs@CM+L组均观察到明显的DNA损伤。定量分析-H2AX的绿色荧光强度也发现DNPs+L和DNPs@CM+L组的荧光强度明显大于其他三组。这两个实验表明，DNPs可以通过诱导线粒体膜电位变化和DNA损伤，诱导980 nm激光照射后的肿瘤细胞死亡。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒检测不同处理组细胞凋亡情况。DNPs+L和DNPs@CM+L组早期和晚期凋亡细胞比例增加，晚期凋亡细胞分别占44.4%和47%，明显高于其他组。光疗过程中产生的大量ROS可激活P53，增加促凋亡蛋白Bax的表达，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。这些变化促进caspase-3裂解为活性形式，从而诱导线粒体介导的肿瘤细胞凋亡。最终，我们的Western blot实验证实，在dnps介导的光疗后，Bax和cleaved caspase 3的表达增加，而Bcl-2的表达减少。这些结果表明，基于A-D-A结构的dpcn2f制备的纳米粒子具有较强的ICT、低带隙、高效的ISC和较高的光热转换效率，可以在980 nm激光照射下产生良好的PTT和PDT效果。这导致线粒体膜电位的改变和DNA损伤的诱导，同时也调节凋亡相关蛋白的表达，从而促进肿瘤细胞死亡。
体外诱导ICD、抗原吸附和树突状细胞成熟
研究表明PTT和PDT可诱导肿瘤ICD。死亡或垂死的细胞释放出大量的肿瘤抗原和损伤相关分子模式(DAMPs)，主要是暴露在细胞膜表面的钙网蛋白(CRT)，以及大量的高迁移率群盒1 (HMGB1)从细胞核释放到细胞外环境，从而刺激树突状细胞(DC)的募集和成熟，促进抗原提呈。本研究中，细胞经CRT染色后，DNPs+L和DNPs@CM+L组细胞膜上可见丰富的绿色荧光，而PBS、PBS+L和DNPs组的绿色荧光强度较弱。定量分析绿色荧光也显示了类似的结果。用HMGB1染色细胞后，PBS、PBS+L和DNPs组细胞核表面可见较强的绿色荧光，而DNPs+L和DNPs@CM+L组荧光强度较弱。定量分析显示类似的结果表明PTT和PDT诱导细胞核中表达的HMGB1释放到细胞外环境。这些发现证实了dnps诱导的PTT和PDT能够放大氧化应激，促进肿瘤细胞的ICD。为了增强DNPs在体内的协同光疗和免疫治疗能力，增加其在体内对ICD的持续诱导，本研究在动物实验中使用了明矾。氢氧化铝是最早被FDA批准用于疫苗生产的佐剂之一，它可以吸附抗原，并在光疗过程中协同刺激DC成熟，从而增强抗肿瘤免疫应答。明矾捕获抗原的能力首次得到证实。DLS检测显示，与抗原共孵育后，明矾的平均粒径从458 nm增加到712 nm，表面电荷由正变为负。此外，SDS-PAGE和考马塞蓝染色显示，在细胞裂解后，明矾单独处理和与细胞裂解液共孵卵后，上清液发生了显著变化，证实了明矾强大的抗原捕获能力。抗肿瘤免疫应答首先需要抗原呈递细胞(antigen-presenting cells, APC)的识别、加工和抗原呈递，其中DC成熟在适应性免疫中起着至关重要的作用。为了验证明矾刺激DC成熟的能力，我们使用Transwell共培养系统对肿瘤细胞和DC进行共培养。FCM显示，与PBS组(34.7%)和DNPs组(35.6%)相比，DNPs+L+Alum组DC (CD11c+ CD80+ CD86+)的成熟度显著提高，达到87.4%，DNPs+L组和Alum组分别为47.1%和73.6%。综上所述，在980 nm激光照射下，DNPs有效暴露肿瘤相关抗原(TAA)，而明矾则表现出捕获抗原和刺激DC成熟的能力。
体内抗肿瘤性能
在之前的实验中，我们分别验证了DNPs在980 nm激光照射下的PTT和PDT效应。此外，我们证实了明矾刺激抗原吸附和DC成熟的能力，先前的文献支持其在动物肿瘤治疗中的应用。在随后的实验中，为了评估宫颈癌治疗在体内的治疗效果，我们构建了更具临床相关性的宫颈癌小鼠模型，并采用阴道原位治疗。宫颈肿瘤局部发生后，采用小动物活体成像系统检测生物发光强度，当其达到1 × 106光子(p) s−1 cm−2 sr−1时，将小鼠随机分为PBS、PBS+L、DNPs@CM、Alum、DNPs@CM+L和DNPs@CM+Alum+L 6组(n = 5)。各组小鼠分别于第1天和第5天给予治疗。在此期间，使用活体动物成像监测肿瘤生长情况。第10天对小鼠实施安乐死，并对其解剖器官进行检查。实时成像结果显示PBS、PBS+L、DNPs@CM和Alum组无明显治疗效果，而DNPs@CM+L和DNPs@CM+Alum+L组肿瘤明显缩小;这种效果尤其明显，DNPs@CM+Alum+L组有5只小鼠的肿瘤完全消失。在相应的小鼠生殖器官解剖图像中也观察到类似的结果。解剖小鼠后，测定第10天宫颈肿瘤体积和生物发光成像荧光强度。DNPs@CM+L、DNPs@CM+Alum+L与其他组之间存在显著差异。添加明矾的DNPs@CM+明矾+L组疗效最佳。此外，在整个治疗期间对小鼠体重的持续观察没有发现明显变化。
光免疫疗法的体内免疫效应
H&E染色宫颈肿瘤组织病理切片显示DNPs@CM+L组和DNPs@CM+Alum+L组肿瘤细胞大量凋亡和坏死。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP Nick End Labeling (TUNEL)荧光染色显示广泛的红色荧光，尤其在DNPs@CM+Alum+L组。这些实验证明了DNPs在980 nm激光照射下具有良好的体内抗肿瘤治疗作用。铝诱导的持续性ICD，由于其抗原吸附和刺激DC成熟的能力，从而显示出优越的抗肿瘤效果。为了验证DNPs联合明胶在980 nm激光激发下诱导DC成熟和激活效应T细胞的能力，采用流式细胞仪分析肿瘤中T细胞和DC的表达。与PBS组相比，DNPs@CM+L和DNPs@CM+Alum+L组T细胞数量明显增加，CD8+ T细胞比例分别从0.92%增加到6.84%和7.93%，CD4+ T细胞比例分别从0.78%增加到6.11%和6.38%。效应t细胞功能的激活与DC成熟有关。因此，当靶向CD11c+、CD80+和CD86+抗体标记的DC时，FCM显示DNPs@CM+L和DNPs@CM+Alum+L组成熟DC (CD80+ CD86+)的百分比比PBS组显著增加，分别从16%增加到27.7%和32%。
同时研究了脾脏中T细胞的含量。与PBS组相比，DNPs@CM+L和DNPs@CM+Alum+L组CD8+和CD4+ T细胞数量增加。上述结果表明，980 nm激光照射DNPs联合免疫佐剂明胶诱导小鼠DC成熟，进一步促进效应T细胞的活化。这种光疗和免疫治疗的协同作用在宫颈癌治疗中起着治疗作用。为了进一步验证DNPs在动物治疗中的生物相容性，在治疗终止后解剖所有小鼠。采集心、肝、脾、肺、肾等重要脏器进行H&E染色，采血进行全血分析、肝肾功能及生化分析。未发现异常，表明使用DNPs作为动物治疗的主要材料是安全的，对小鼠的整体健康没有明显的不良影响。
总结
我们开发了一种新的A-D-A小分子DTPCN2F，它可以被长波近红外光激发，并且具有很高的摩尔消光系数。其独特的分子结构使其具有窄带隙和优异的ISC性能。采用纳米沉淀策略，将DTPC-N2F包裹在DSPE-PEG5000纳米颗粒中形成DNPs，导致光吸收光谱出现明显的红移。在980 nm激光激发下，DNPs能够穿透深层组织，具有较高的光热转换效率，良好的PTT、I型和II型PDT功能(促进1O2、·O2−和·OH的生成)，以及良好的生物相容性。体外实验表明，光疗引起线粒体膜电位、DNA损伤和凋亡标志物表达的改变，促进细胞凋亡。为了增强原位宫颈癌靶向能力，我们提取肿瘤细胞膜包封DNPs形成DNPs@CM。鉴于其独特的生理特性，我们提出了A-D-A纳米聚集体与光纤介入技术耦合的宫颈癌无创治疗策略。其有效性已在原位宫颈癌动物模型中得到证实，为临床早期宫颈癌治疗提供了新的见解。癌症转移是癌症相关死亡的主要原因。结合临床铝佐剂凝胶，开发了一种新的光免疫治疗宫颈癌策略，利用光疗诱导的高效免疫原性细胞死亡和免疫佐剂构建原位肿瘤疫苗。这种方法激活机体的抗肿瘤免疫反应，包括促进DC成熟和刺激记忆T细胞分化，有效抑制宫颈癌转移。其有效性已在腹腔内转移动物模型中得到证实。该无创治疗策略将A-D-A结构纳米聚集体和铝佐剂凝胶与光纤介入技术相结合，具有高效、安全、便捷的特点。该方法为临床治疗早期和晚期宫颈癌提供了新的思路。
参考文献
An Acceptor–Donor–Acceptor Structured Nano-Aggregate for NIR-Triggered Interventional Photoimmunotherapy of Cervical Cancer Gaoli Niu, Xingqi Bi, Yong Kang, Hua Zhao, Ruiyan Li, Mengbin Ding, Baoli Zhou, Yanhong Zhai, Xiaoyuan Ji,* and Yongsheng Chen，Adv. Mater. 2024, 2407199，https://doi.org/10.1002/adma.202407199
