内容提要
在近红外II区 (NIR-II)窗口进行的光声成像(PAI)和光热治疗(PTT)具有无创性和深入组织渗透的优点。这就需要开发具有NIR-II光响应性的高效治疗剂。目前，主要用于NIR-II pai引导PTT的有机诊断试剂是共轭聚合物材料。然而，它们具有较低的体内清除率和长期的生物毒性，限制了它们的临床转化。在本研究中，报道了一种具有NIR-II吸收和纳米包封的有机小分子(CY-1234 nanoparticles (NPs))用于pai引导的PTT。通过在分子的两端引入供体-受体单位，在分子中实现扩展-conjugation。因此，CY-1234在四氢呋喃中的最大吸收峰在1234 nm处。采用F-127包埋法制备了CY-1234纳米聚集体。在NIR-II光照射下，它们的光热转换效率达到76.01%。CY-1234 NPs静脉注射荷瘤小鼠后，在1064 nm激光照射下观察到强的PA信号和良好的肿瘤消融。
结果与讨论
CY-1234的分子设计
扩大共轭效应和增加分子内电荷转移是设计高吸收小分子探针的常用策略。垂直于平面骨架的p轨道上的电子可以自由地穿过共轭体系，从而导致系统中原子之间独特的相互作用。具有共轭双键的大基团通常用于构建近红外吸收探针。当带有电子供体的吲哚苯环在菁染料的两端同时被修饰时，会发生吸收红移。我们通过将苯环环化到3-吲哚基上，在吸收光谱中引起红移，从而获得了扩展的-conjugation。通过引入4,4 ' -二甲氧基-4-联苯胺作为电子供体，在苯并[c,d]吲哚-2-乙基苯胺中增强分子内电荷转移，实现了额外的光谱红移。我们成功地合成了一个有机小分子(CY-1234)，该分子在NIR-II区有一个吸收峰。首先，我们得到CY-1234在各种溶剂中的紫外吸收光谱和荧光发射光谱。CY-1234溶解在有机溶剂中，对NIRII区有较强的吸收。其中THF在1234 nm和1334 nm处有最大吸收峰和最大发射峰。以IR-26为参比，CY-1234的荧光量子效率计算为0.105%。在甲醇基水溶液中，CY-1234的最大吸收峰蓝移至约900 nm，荧光被强烈猝灭。CY-1234光谱的这些变化可能是由于CY-1234从有机溶剂中的单分散状态转变为水中的纳米聚集体。我们假设CY-1234在甲醇的存在下会形成H -聚集体。为了研究CY-1234在水中的聚集模式，我们获得了CY-1234在不同比例的水/甲醇溶剂混合物中的吸收和发射光谱。CY-1234的紫外吸收峰随着甲醇含量的逐渐降低而明显蓝移，荧光减弱，与预期一致。CY-1234在水溶液中可能发生H聚集。这种聚集模式导致荧光猝灭，增加了非辐射跃迁的数量，从而增强了光热效应。
纳米颗粒的制备与表征
我们将疏水性CY-1234与两亲性聚合物F-127共沉淀法制备了CY-1234 NPs。通过动态光散射(DLS)测量CY-1234 NPs的平均直径为55 nm。NPs完全满足通透性和滞留性要求，允许它们在肿瘤新生血管外渗后保留在肿瘤组织中。透射电镜(TEM)图像显示CY-1234 NPs具有均匀的球形形貌。通过获得CY-1234 NPs在水溶液中的吸收和发射光谱，研究了其光学特性。正如预期的那样，CY-1234 NPs在NIR-II窗口中表现出很强的吸收带。与有机溶液相比，水溶液分散引起了980 nm处吸收峰的明显蓝移和荧光猝灭。CY-1234在有机溶剂和水中的吸收和发射光谱对比显示，CY-1234 NPs在水中形成h聚集体，如预期的那样。此外，我们收集了四种不同浓度CY1234 NPs的吸收曲线，并分析了它们在1064 nm处的吸收强度与浓度的相关性。根据线性拟合数据，CY-1234 NPs的摩尔消光系数为2.1 × 104 cm−1 M−1表明CY-1234 NPs具有较强的NIR-II光吸收能力。将1,4 -二苯基-2,3-苯并呋喃加入CY-1234 NPs水溶液中作为检测试剂。随后，用1064 nm激光多次照射溶液，记录照射后的吸收曲线。值得注意的是，辐照后曲线没有明显变化，说明没有产生活性氧。
CY-1234 NPs的光热性质
我们得出CY-1234 NPs在1064 nm处具有很强的光吸收。因此，我们评估了CY-1234 NPs溶液的PA强度。在1064 nm处获得了不同浓度溶液的PA信号。随着CY-1234 NPs浓度的增加，PA信号强度逐渐增大。我们量化了信号强度，发现CY-1234 NPs在1064 nm激光照射下的PA强度与溶液浓度呈满意的线性关系。在水溶液中，CY-1234 NPs在NIR-II光学窗口中表现出吸收带，在1064 nm处具有优异的消光系数和严重的荧光猝灭。因此，我们假设纳米颗粒将表现出最佳的光热效应。为了验证这一假设，我们进一步评估了NPs水溶液将光转化为热的能力。采用1064 nm激光(1.0 W cm−2)连续暴露水溶液10 min，逐渐提高溶液温度。温度的变化取决于溶液的浓度。例如，用浓度为2.5 × 10−5 m的CY-1234 NPs溶液激光照射6分钟，将溶液温度提高到84°C。相比之下，在相同的激光照射条件下，纯水样品的温度升高最小。利用获得的数据和先前报道的方法，计算CY-1234 NPs的PCE为76.01%。该PCE超过了一些传统的小分子NIR-II NPs，甚至超过了有机聚合物纳米颗粒的PCE。通过激光控制的“加热-冷却”过程研究了NPs的光热稳定性。CY-1234 NPs (2.5 × 10−5 m)经过四个周期(1064 nm, 1.0 W cm−2)的激光照射，每个“加热-冷却”周期的最高温度几乎保持不变。同时，我们监测了每个周期后NPs的吸收曲线，未观察到明显变化。这表明CY-1234 NPs具有良好的光热稳定性。CY1234 NPs的高PCE和令人满意的稳定性表明它们在PAI和PTT方面具有相当大的潜力。CY-1234 NPs良好的光热性能，如强吸收和NIR-II范围内的超高PCE，促使我们进一步研究其光热机理。
CY-1234 NPs的体外研究
考虑到CY-1234 NPs在1064 nm激光激发下产生热量的能力，我们使用标准MTT方法评估了它们的生物相容性和抗癌效果。首先，我们检测了不同浓度NPs共孵育12 h后HeLa细胞的PA图像。随着NPs浓度的增加，图像的亮度逐渐增加。随后，我们评估了CY-1234 NPs对HeLa和4T1细胞的潜在细胞毒性和PTT效应。计算得到IC50值约为15.21 μ mL−1。在没有激光照射的情况下观察到更高的细胞活力，表明CY-1234具有高度的生物相容性。相比之下，当CY-1234 NPs处理的细胞用1064 nm激光(1 W cm−2)照射5 min时，细胞活性明显下降。随着CY-1234 NPs浓度的增加，细胞死亡率逐渐升高。用calceinAM和PI试剂对HeLa细胞进行荧光染色，在共聚焦显微镜下观察细胞活力。当NPs或激光单独处理时，细胞表现出最小的凋亡。相比之下，CY-1234 NPs (100 × 10−6 m)和激光照射时，它们表现出明显的细胞死亡。为了获得更准确的结果，我们使用流式细胞术量化CY-1234 NPs引导PTT对HeLa细胞的效率。图中显示了分析结果。CY-1234 NPs和激光单独照射均未见明显的细胞凋亡(<1%)。CY-1234 NPs处理后再加1064 nm激光照射，细胞凋亡率达到97%。这表明CY-1234 NPs在1064nm激光激发下对肿瘤细胞具有良好的体外生物安全性和光热治疗能力。
CY-1234 NPs的体内研究
CY-1234 NPs的体内NIR-II PAI在皮下植入4T1癌细胞的小鼠模型中得到证实。经尾静脉注射CY-1234 NPs (1 mg mL−1 200 μL)后，肿瘤细胞的PA信号强度随时间逐渐增加，在注射后12 h达到最大值。此时，与未注射探针时相比，pa信号强度增加了约5倍。结果表明CY-1234 NPs在肿瘤区域成功积累，通透性增强。12 h后，pa信号强度逐渐降低。这表明CY-1234 NPs可以潜在地用于NIR-II PAI的肿瘤诊断。CY-1234 NPs尾静脉注射后，监测其在不同时间点的生物分布，并初步研究其在活体小鼠体内的药代动力学行为。注射后12 h，肝脏pa信号强度最高，其次是脾脏。其余器官的信号强度可以忽略不计，表明CY-1234 NPs在体内主要由肝脏和胆囊代谢。随着时间的推移，这些器官发出的PA信号逐渐减弱。PTT使用药物来吸收非侵入性光能并将其转化为可控的热量，以使肿瘤细胞死亡。[24]优秀的治疗剂具有较高的光热转换效率。我们在体内评估了CY-1234 NPs对肿瘤的PTT性能。将荷瘤小鼠分为4组，i) PBS组，ii) CY-1234 NP组，iii) 1064 nm光组，iv) CY-1234 NPs + 1064 nm光组，每组3只。CY-1234 NPs (200 μL, 0.5 mg mL−1)经尾静脉注射，12 h后用1064 nm (1 W cm−2)激光连续照射肿瘤区域。随后，通过红外热像仪记录温度变化。CY-1234 NPs + 1064 nm光组在10 min内温度显著升高至约63℃，而PBS + 1064 nm光组的最高温度仅为41℃。光照射后每2 d记录各组小鼠肿瘤体积和总重，连续14 d。随着时间的推移，(iv)组肿瘤体积没有明显增加，而其他组肿瘤体积明显增加。照射2周后，将小鼠安乐死，保存主要脏器和肿瘤组织。对比计算表明，(iv)组的抑瘤率(85.9%)高于其他三组，说明CY-1234 NPs在NIR-II光作用下具有较高的抗肿瘤作用。
总结
我们设计并成功合成了一种在有机溶液中具有1234 nm NIR-II吸收峰的pai引导PTT小分子纳米治疗剂。共沉淀法制备的CY-1234 NPs在较宽的浓度范围(0 ~ 200 μg mL−1)内具有良好的生物安全性。此外，我们在CY-1234 NPs处理和1064 nm激光照射下，HeLa细胞的凋亡率超过97%。值得注意的是，CY-1234 NPs在PAI引导下有效抑制小鼠的4T1肿瘤。组织学分析显示，CY-1234 NPs在小鼠中未引起任何明显的异常、病变和功能障碍，强调了CY-1234 NPs的生物相容性和安全性。本研究提出了一种高效的小分子PTA，有助于小分子纳米探针的临床应用。同时为未来深部肿瘤的影像学和治疗提供了新的思路。
参考文献
Small-Molecule Phototheranostic Agent with Extended -Conjugation for Efficient NIR-II Photoacoustic-Imaging-Guided Photothermal Therapy Zhen Wang, Yu Liu, Chunxu He, Xinmin Zhang, Xi Li, Yuanyuan Li, Yufu Tang, Xiaomei Lu,* and Quli Fan*，Small 2024, 20, 2307829，https://doi.org/10.1002/smll.202307829
