内容提要
本文构建了一种具有靶向代谢重编程能力的纳米体工程NIR-II纳米佐剂，用于增强NIR-II光热-铁凋亡免疫治疗。通过金属铁离子介导的D-A-D型NIR-II分子的配位自组装，并负载糖酵解抑制剂2-脱氧-d -葡萄糖(2DG)，然后用aPD-L1纳米体(Nb)修饰制备纳米佐剂(2DG@FS-Nb)，可以有效靶向免疫抑制TME并触发原位免疫检查点阻断。纳米佐剂在酸性TME中响应性释放治疗成分，通过NIR-II荧光/光声成像精确定位肿瘤，同时启动NIR-II光热-铁凋亡治疗。显著的NIR-II光热效率和谷胱甘肽(GSH)耗损升高进一步致敏铁凋亡，诱导严重的脂质过氧化，引发强大的免疫原性细胞死亡(ICD)，从而引发抗肿瘤免疫反应。
结果与讨论
2DG@FS-Nb的制备与表征
合成了羧基功能化D-A-D型NIR-II有机小分子Se-TC，其中以[1,2,5]硒二唑[3,4f]苯并[c][1,2,5]噻二唑为电子受体单元，噻吩和芴为电子给体单元。THF中Se-TC的吸收光谱在500 ~ 1100nm有较宽的吸收范围，在≈920nm处有一个较强的吸收峰。此外，在808 nm激光激发下，Se-TC的荧光发射延伸至1400 nm，在1100 nm处达到峰值。aPD-L1纳米体(Nb)的序列和制备过程见方案。通过Fe(III)驱动Se-TC的配位自组装制备了NIR-II纳米杂化物，其在THF中呈现均匀分散的球形形貌。为了获得具有Nb修饰的水溶性纳米佐剂，将糖酵解抑制剂2DG加载到自组装的纳米结构中，然后用长链PEG修饰，并与aPD-L1纳米体偶联，形成具有肿瘤靶向和代谢调节能力的NIRII免疫调节纳米佐剂(2DG@FS-Nb)。aPD-L1纳米体和2DG@FS-Nb对PD-L1抗原均表现出较高的结合活性，表明抗体偶联不会改变纳米体的抗原结合能力。值得注意的是，与游离Se-TC相比，2DG@FS-Nb的吸收表现出由分子聚集引起的明显红移，并且在1064 nm处有明显的吸收。此外，在808 nm激光激发下，2DG@FS-Nb在900 ~ 1400 nm范围内发出了突出的荧光发射。在1064 nm (1 W/cm2)激光照射下，研究了自组装纳米佐剂的NIR-II光热性能。如图所示，2DG@FS-Nb随着浓度和时间的增加，温度迅速升高，在200 μg mL−1的高浓度下，最高温度达到67.4℃，这可以从红外热图像的浓度和时间依赖性增强中得到证明。调节激光功率密度(0.5 ~ 1.5 W cm−2)可以显著影响溶液的温度变化。通过连续的激光开/关循环，重复加热/冷却循环对最高温度的衰减可以忽略，说明2DG@FS-Nb具有良好的光热稳定性。通过加热/冷却循环计算得出光热转换效率()≈30.15%，进一步证实2DG@FS-Nb可以作为一种有效的NIR-II光热剂用于肿瘤消融。由于2DG@FS-Nb优异的光吸收能力，在1064 nm激光激发下，2DG@FS-Nb溶液的光声图像呈现出浓度依赖性的光声信号增强。为了探索2DG@FS-Nb通过Fe(III)介导的Fenton反应催化H2O2生成∙OH的能力，选择TMB作为捕获探针，其可被∙OH氧化为蓝色oxTMB。加入2DG@FS-Nb后，在H2O2存在下，无色溶液变成蓝色，在≈652 nm处有一个显著的吸收峰，说明2DG@FS-Nb具有芬顿活性。此外，加入不同浓度的H2O2后，TMB和2DG@FSNb的溶液呈现出渐变的颜色变化，这可以通过吸收率的增加来验证。采用1064 nm激光照射2DG@FS-Nb处理过的TMB和H2O2溶液，进一步探讨NIR-II光热性能对∙OH生成的影响。如图所示，NIR-II激光照射明显增加了TMB的氧化，其吸收带比未照射时更高。该结果证实了NIR-II光热效应诱导的热疗可以增强2DG@FS-Nb的Fenton活性，并通过光热促进电离促进∙OH的生成。
细胞靶向摄取谷胱甘肽耗竭，脂质过氧化和线粒体去极化
由于Rhodamine B (RhB)具有优异的光学性能，我们将RhB掺杂的2DG@FS和2DG@FS-Nb加入到4T1细胞中，通过流式细胞术评估nb介导的阳性靶向能力。结果显示，2DG@FS-Nb处理的4T1细胞显示出显著的RhB荧光，其摄取率比2DG@FS处理组高3.08倍。细胞内荧光图像显示2DG@FS-Nb的细胞摄取随时间的变化。孵育4小时后，2DG@FS-Nb逐渐迁移到细胞质中，细胞核周围荧光增强。在三维细胞球体摄取实验中，2DG@FS-Nb组比2DG@FS组向球体内扩散的绿色荧光更多，细胞球体内穿透深度更深。这些结果表明，通过肿瘤细胞表面的Nb对PD-L1的主动识别和结合，可以改善细胞内2DG@FS-Nb的摄取。肿瘤细胞中过表达的谷胱甘肽是一种清除ros的抗氧化剂，也是gpx4催化脂质修复的辅助因子。因此，GSH耗竭在LPO增强和铁下垂中起重要作用。FS-Nb和2DG@FS-Nb处理的4T1细胞中GSH水平明显降低，这是由于Fe(III)和GSH之间的还原反应。此外，2DG@FS-Nb + 1064 nm激光照射处理后，GSH含量进一步降低，比2DG@FS-Nb-treated组降低了1.66倍。NIR-II激光照射引起的局部热疗可促进gsh介导的Fe(III)还原为Fe(II)和生成谷胱甘肽二硫(GSSG)，从而进一步抑制GPX4的表达。如图所示，经western blotting分析，2DG@FS-Nb +激光照射处理的细胞GPX4表达最低。FS-Nb组和2DG@FS-Nb组GPX4免疫荧光明显减弱。
体外ICD效应、BMDC激活和巨噬细胞极化
2DG@FS-Nb通过糖酵解抑制和NIR-II PTT-ferroptosis的协同治疗，不仅触发肿瘤细胞凋亡，还通过诱导ICD效应引发抗肿瘤免疫反应，并伴随DAMPs的释放。这促进了抗原呈递细胞的成熟，从而招募和激活更多的细胞毒性T淋巴细胞。钙网蛋白(calreticulin, CRT)作为ICD的标志物，在应激刺激下从内质网转移到肿瘤细胞表面，然后结合到DC的膜表面，刺激DC成熟。在不同处理后的4T1细胞中检测CRT表面暴露。免疫荧光染色显示，FS-Nb和2DG@FS-Nb处理的4T1细胞表面可见明显的CRT红色荧光，表明由于铁下沉和糖酵解阻塞的协同作用，CRT表面暴露明显。值得注意的是，2DG@FS-Nb +激光照射治疗组的CRT荧光较2DG@FS-Nb治疗组增强了约2.79倍，说明NIR-II PTT的治疗效果可以促进CRT的释放。另一个重要的ICD标志物，高迁移率组框1 (HMGB1)，在凋亡应激时从细胞核释放到细胞外基质，触发成熟dc分泌促炎因子。在2DG@FS-Nb +激光照射处理的细胞核中，荧光衰减最为严重，与对照组相比，荧光衰减约为12.66倍，表明HMGB1从细胞核中释放最为明显。这些结果证实2DG@FS-Nb可以通过NIR-II激光照射有效引发ICD效应和随后的免疫应答。
NIR-II FI和NIR-II PAI在体外和体内的研究
为了评估Nb介导的肿瘤活性靶向能力，我们用2DG@FS和2DG@FS-Nb孵育4T1细胞，检测细胞的NIR-II FI。在2DG@FS-Nb处理的细胞中观察到更高的NIR-II荧光信号，与2DG@FS-treated组相比增强了1.96倍，这是由于Nb与肿瘤细胞上表达的PD-L1的活性结合。同时，2DG@FS-Nb处理的4T1细胞显示出浓度依赖性的NIR-II荧光图像，表明2DG@FS-Nb具有优异的细胞内摄取能力，可通过NIR-II FI可视化深部肿瘤细胞。为了探讨2DG@FS-Nb在体内进行NIR-II FI的可行性，我们在10min后通过尾静脉注射对小鼠血管进行NIR-II FI。高对比显示小鼠全身血管，尤其是腹部和后肢血管清晰可见。在标记的血管中，测量到的横截面强度剖面的半最大值全宽度(FWHM)分别为≈0.640和0.607 mm，显示出较高的成像分辨率和SBR。为了给协同抗肿瘤免疫治疗提供精确的指导，我们建立了异种移植4T1肿瘤模型，进一步研究2DG@FS-Nb的NIR-II FI能力。静脉注射后，肿瘤区域NIR-II荧光亮度随时间增加，在注射后12 h达到峰值，与注射后10 min相比增强了约7.49倍。注射后24 h，肝脏、脾脏和肿瘤区域的NIR-II荧光信号高于其他脏器，验证了2DG@FS-Nb在这些脏器中的优先积累，为药代动力学评价提供了有效指导。
体内协同抗肿瘤免疫治疗
为了评价2DG@FS-Nb的抗肿瘤治疗效果和免疫应答，我们建立了双侧同基因4T1荷瘤BALB/c小鼠模型(原发和远端)。将4T1荷瘤小鼠分为6组，分别进行不同的治疗。处理过程如图所示。注射后12 h，对FS-Nb和2DG@FSNb注射组的原发肿瘤进行1064 nm激光照射(1 W cm−2,10 min)，获得肿瘤区域的红外热图像。肿瘤温度可在1分钟内迅速上升至50℃，有效消融肿瘤。在各种治疗后，持续监测原发和远处肿瘤的体积变化。如图所示，与PBS组相比，由于ICB和铁下垂的联合治疗效果，Nb和FS-Nb治疗组的原发肿瘤和远处肿瘤生长明显受到抑制。值得注意的是，由于NIR-II ptt诱导的协同免疫反应，激光照射可以显著增强肿瘤生长抑制。重要的是，与FS-Nb +激光照射相比，2DG@FS-Nb +激光照射对原发肿瘤和远处肿瘤表现出更高的生长抑制，抑制率分别为≈77.92%和52.62%，这归因于2dg介导的糖酵解代谢紊乱和随后对免疫抑制TME的调节。治疗14天后，各治疗组肿瘤照片显示出明显不同的肿瘤大小。与pbs治疗组相比，2DG@FSNb +激光治疗组的肿瘤重量要低得多(原发和远处肿瘤分别为0.23和0.36 g)。H&E染色图像显示，2DG@FS-Nb +激光照射组肿瘤组织细胞损伤和坏死最为严重。经过各种处理，各组体重在14天内基本稳定。H&E染色病理分析未见主要脏器(心、肝、脾、肾)损伤。此外，2DG@FS-Nb在不同浓度下表现出较低的溶血率。这些结果验证了2DG@FS-Nb具有良好的生物相容性和生物安全性。
总结
本研究通过金属铁离子驱动NIR-II分子的配位自组装，然后负载糖酵解抑制剂，再用Nb修饰，制备了一种具有TME重编程能力的新型免疫调节NIR-II纳米佐剂(2DG@FS-Nb)。在nb介导的阳性肿瘤靶向和ICB之后，随后是tme触发的快速货物释放，2DG@FS-Nb使NIR-II FI/ pai引导的NIR-II PTT扩增铁上沉，引发强大的ICD和免疫反应。更重要的是，2DG@FS-Nb通过LA外排抑制调节和重塑免疫抑制TME，从而协同放大免疫治疗的效率。本研究提供了一种通过NIR-II光疗和肿瘤代谢重编程结合ICB来增加免疫输出的新策略。
参考文献
Metal-Coordinated NIR-II Nanoadjuvants with Nanobody Conjugation for Potentiating Immunotherapy by Tumor Metabolism Reprogramming， Yeneng Dai, Ziang Guo, Dongliang Leng, Guanda Jiao, Kai Chen, Mingxuan Fu, Yang Liu,Qingming Shen, Qi Wang,* Lipeng Zhu,* and Qi Zhao， Adv. Sci. 2024, 2404886，https://doi.org/10.1002/advs.202404886
