内容提要
光声成像是生物医学研究中一种重要的无创成像技术。小分子-秒近红外窗口(NIR-II) PA染料结合成像数据可以提供全面深入的体内生理病理信息。然而，由于缺乏易于光学调节的基团，NIR-II PA染料通常表现出“永远在线”的特性，这阻碍了其在体内的进一步应用。本文设计合成了一类新型染料GX作为可活化的NIR-II PA平台，GX-5的吸收/发射波长可达1082/1360 nm。重要的是，GX染料在NIRII PA 3D成像中对小鼠血管结构具有很强的组织穿透深度和高分辨率，在NIRII荧光(FL)成像中具有高信噪比。此外，为了证明GX染料的适用性，我们设计了第一个由一氧化碳(CO)激活的NIR-II PA探针GX-5-CO，并通过高对比度NIR-II PA和FL成像来揭示高血压小鼠CO水平的提高。我们期望GX染料的许多衍生物将被开发出来，以提供多功能的NIR-II PA平台，用于设计各种可活化的NIR-II PA探针作为生物医学工具。
结果与讨论
传统的NIR-II PA染料包括供体-受体-供体(D- A-D)和聚亚甲基(D-π-A)荧光团，两者都具有长共轭结构。然而，这些染料通常缺乏光学可调基团，使它们无法成为复杂生物体中特定生物标志物的理想的NIRII PA染料。罗丹明染料及其酰胺衍生物具有独特的光学开关特性，广泛应用于体内特异性开放光学成像支架。然而，传统的罗丹明染料往往局限于可见光区的吸收和发射。我们之前的工作表明，通过Fischer醛扩展罗丹明的共轭结构会导致吸收和发射的显着色移。因此，通过扩展共轭结构使罗丹明衍生物的吸收和发射波长发生红移是可行的。然而，Fischer醛延伸到罗丹明衍生物只会使吸收和发射波长红移到近红外波段。或者，我们推测在罗丹明骨架中引入具有较长共轭结构的杂蒽端基X1-5可能会进一步使罗丹明衍生物的波长红移。为此，我们首先比较了xanthene衍生物X-1与Fisher醛的吸收和发射波长，发现X-1相对于Fisher醛分别红移了60/81 nm。另一方面，最简单的罗丹明荧光团罗丹明110的最大吸收和发射波长为497/520 nm，而罗丹明B的最大吸收和发射波长为λAbs/λem =548/572 nm，这表明对罗丹明衍生物进行端基修饰可能会引起吸收/发射波长的色移。富电子杂蒽衍生物的引入可以进一步增强其推挽电子体系，从而进一步延长罗丹明衍生物的吸收和发射波长。
在杂环中引入更多的富电子氮杂环可以进一步减小HOMO/LUMO能隙，延长吸收和发射波长。此外，罗丹明骨架结构GC是一个明显的吸电子结构。GC部分的优点是能够发出打开和关闭的信号。当杂蒽供体片段与GC片段结合形成光声染料时，这些染料将具有“可活化”的特性。同时，与闭合状态的GC相比，开环化合物GC的ESP值更高，正负电位分布更均匀，产生更强的推挽电子效应，促进电荷转移的发生。
二乙胺端基有很强的给电子能力。化合物GC的二乙基氨基HOMO上的电子密度很好地离域到氧杂环核。因此，富电子二乙胺部分的存在可以显著降低氧化电位，增强分子内电荷转移能力，促进波长进一步红移。基于这些考虑，我们设计了一系列具有不同取代基的NIR-II PA染料GX1-5。我们预计GX1-5可能具有不同的吸收和发射波长。
为了得到罗丹明基NIR-II型PA染料，合成了GX1-5型PA染料。GX1-5的结构通过1H NMR、13C NMR和HRMS(高分辨率质谱)进行了全面表征。我们研究了GX染料在不同溶剂中的光物理性质。其中，GX1-5在1,2-二氯乙烷(DCE)中的荧光量子产率分别为0.143%、0.177%、0.901%、1.150%和1.003%(表S7-S9)。GX1-5在H2O中的最大吸收/发射波长分别为691/924 nm、736/928 nm、889/1035 nm、896/1048 nm和905/1066 nm。值得注意的是，GX-5在H2O中的吸收/发射波长可以扩展到1082/1360 nm。这可能是溶剂效应的结果。染料GX在水体系中的优异性能表明新型NIR-II PA染料在生物体系中具有广泛的应用前景。与先前构建的近红外I罗丹明衍生物CS (Scheme S6)相比，GX-5的最大吸收波长红移超过200 nm。上述结果表明，GX染料对NIR-II染料具有吸收和发射作用。值得注意的是，为了验证GX染料优越的光稳定性，以临床批准的ICG作为参考，用连续波激光照射GX1-5溶液。60 min后，ICG的吸收强度下降约60%，而GX1-5的吸收强度仅下降1-14%，说明GX染料比ICG更具光稳定性。此外，我们进一步比较了染料GX1-5与ICG在血液中的稳定性，发现染料GX1-5的光稳定性仍然远好于ICG。为了说明GX染料的潜在生物学适用性，我们对它们进行了一系列常见活性氧(如ONOO、H2O2、HClO)和生物学相关亲核试剂(如H2S、GSH和Cys)的测试，以评估其化学稳定性。进一步测试了染料GX1-5在生理盐水和FBS中的溶解度，发现GX1-5具有良好的溶解度。GX染料具有良好的光稳定性和化学稳定性，进一步证明了其在生物成像领域应用的可行性。为了探索染料GX对PA成像的潜力，我们首先在HEPES溶液(10 mM, pH 7.4，含有10% DMSO和1% tween-80)中进行了PA传感测试。GX1-5表现出良好的PA信号， NIR-II表现出良好的FL信号。同时，我们检测了GX染料在激光照射3 h内PA和FL信号的变化。市售染料ICG在90min后几乎没有信号，而GX1-5在3h时仍然显示出良好的PA和FL信号。这些结果表明，染料GX可能是良好的NIR-II PA和FL显像剂在体内的应用。
一种优良的NIR-II染料用于生物医学成像的先决条件是低细胞毒性。染料GX具有极低的细胞毒性。接下来，我们在体内研究了NIR- ii GX染料相对于NIR-I罗丹明衍生物CS的优势。GX1-5和CS分别注射到活小鼠体内。其中，CX-5的组织穿透深度可达10 mm，而CS在3D PA成像中仅为5 mm。同时，通过NIR-II 3D PA成像和2D FL成像系统，我们发现GX-5仍然具有长达6小时的长期生物成像能力，而CS在6小时内几乎没有检测到信号。以上结果表明，GX染料可以应用于多种成像方式，检测生物深部组织，获得多路信息。相比之下，许多染料(包括近红外I型染料)在穿透深度和实时成像方面受到限制，导致获取高质量图像和视频的障碍。在本研究中，我们使用GX-5或CS对小鼠全身进行NIR-II PA和FL成像。GX-5能清晰区分小鼠血管。即使在640×512像素的分辨率下，GX-5也可以提供高信噪比的NIR-II 2D FL图像。在“1”“2”“3”处的容器在半最大值处的全宽度通过高斯拟合进行拟合，甚至可以区分直径为0.21 mm的容器。更重要的是，GX-5通过高分辨率NIR-II PA成像更全面地显示了小鼠血管的分布情况。GX5的3D NIR-II PA成像视频从多个角度获得了小鼠全身血管的分布情况。此外，通过3D NIR-II PA成像可以观察到血管系统(4条纵向血管)。值得注意的是，3D NIR-II PA的血管分辨率优于2D FL成像。这进一步表明GX-5可能具有出色的NIR-II 3D PA成像和2D FL成像能力。与之形成鲜明对比的是，CS，近红外I罗丹明衍生物，无法对血管系统进行高分辨率成像。这些结果表明，NIR- ii罗丹明衍生物染料GX比NIR-I罗丹明染料具有更好的实时和高对比度的体内成像能力。GX染料优良的NIR-II PA和FL特性可为外科手术对全身血管的精确导航奠定坚实的基础。
为了探究GX-5CO在溶液中的NIR-II PA成像能力，我们将GX-5-CO与不同浓度的CO孵育，随着CORM-3浓度的增加，PA信号逐渐增加至饱和。GX-5-CO在FL成像中也表现出类似的现象。为了探索GX-5-CO在生物系统中的适用性，我们采用MTT法将GX-5-CO与HeLa细胞孵育，观察到GX-5-CO具有较低的细胞毒性。此外，为了评估探针在体内对CO的特异性反应，小鼠皮下注射GX-5-CO和不同浓度的CORM-3。仅用GX-5-CO处理的小鼠表现出微弱的NIR-II PA和FL信号。
随着CORM-3剂量的增加，可以观察到PA信号的显著增强。同时，FL成像也得到了类似的结果。上述结果表明，GX-5-CO可用于NIR-II PA/FL成像，实时无创检测体内CO水平上调。高血压是导致缺血性心脏病、心力衰竭和血管性痴呆等疾病的主要原因。CO代谢和功能的改变与高血压的发病和维持密切相关。因此，探讨高血压期间CO的变化对进一步了解高血压的发病机制和病理进展具有重要意义。为了研究GX-5-CO对高血压小鼠特异性成像的能力，我们用血管紧张素II (Ang II)建立了高血压小鼠模型。氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪是治疗高血压的常用药物。据文献报道，三者结合可以达到更好的治疗效果。因此，我们进一步用氨氯地平、缬沙坦和氢氯噻嗪治疗高血压小鼠。采用无创血压测量系统对正常小鼠、高血压小鼠和治疗小鼠的血压进行了研究。
对照组小鼠舒张压(DBP)和收缩压(SBP)分别为73和96 mmHg，高血压组小鼠舒张压(DBP)和收缩压(SBP)分别升高至112和145 mmHg。这表明高血压小鼠模型构建成功。并且观察到，治疗组小鼠的血压与对照组小鼠基本相同，表明高血压治疗小鼠模型构建成功。然后用PA/ FL成像观察高血压小鼠和正常小鼠在不同时间点GX-5-CO信号的变化。对照组和实验组小鼠注射GX-5-CO后均未获得明显的PA/FL信号。对于高血压小鼠，NIR-II 3D PA和实时FL成像信号均随时间逐渐升高，在4 h后达到最大值。这些数据为GX-5-CO在高血压小鼠中的视觉检测和治疗提供了进一步的证据。在对空白组、高血压组、高血压治疗组小鼠成像后，分别取各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾，探查各脏器的分布。我们发现只有高血压组小鼠显示荧光点亮，且荧光主要集中在肝组织，其他器官分布较少。这可能是因为肝脏是人体的主要代谢器官。综上所述，新型NIR-II探针GX-5-CO可以对高血压小鼠内源性CO进行成像。
总结
我们通过螺旋环化设计合成了一类具有羧酸控制光开关机制的NIR-II PA染料GX，其吸收/发射波长可达1082/1360 nm。DFT理论计算表明，染料GX具有罗丹明染料的典型结构特征。GX-5与可见光区罗丹明B和近红外I罗丹明染料CS相比，分子轨道间隙更小，偶极矩更大。重要的是，为了进一步证明染料GX出色的光学和PA特性，我们利用GX-5分别通过PA和FL成像在3D和2D上可视化小鼠血管的分布和结构。此外，我们以GX-5为激活平台，进一步构建了首个特异检测CO的NIR-II探针GX-5-CO，通过高对比度NIR-II PA和FL成像，揭示了高血压小鼠体内CO水平的提高，证明了我们的新型GX NIR-II功能性罗丹明染料的价值。我们期待这项工作不仅可以启发研究者开发高效的靶向激活PA探针的小分子NIR-II平台，也将推动NIR-II染料在PA成像中的进一步应用，以实现准确的成像指导诊断和疾病部位的手术。
参考文献
A Class of Activatable NIR-II Photoacoustic Dyes for High-Contrast Bioimaging Jiangfeng Li, Jiangyan Wang, Lizhen Xu, Hanwen Chi, Xing Liang, Juyoung Yoon,* and Weiying Lin*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202312632. doi.org/10.1002/anie.202312632
