内容提要
光声(或光声)成像有望实现微分辨率无创生物成像，其穿透深度(>cm)远高于荧光成像。然而，酶活性的光声成像将需要大声的、光稳定的、吸收nir的分子造影剂，这仍然是未知的。大多数有机分子造影剂是重新利用荧光团，在光声成像下具有严重的光不稳定性或光毒性，这是它们缓慢的S1→S0电子弛豫的结果。我们现在报告，已知的荧光团可以合理地修改，以达到超快的S1→S0速率，而不需要太多额外的分子复杂性，只需将它们与分子开关合并。在这里，我们将偶氮苯开关与菁染料合并，以实现超快弛豫(<10 ps， >100倍快)。在不调整仪器设置的情况下，这些偶氮胺类化合物在信号寿命(光稳定性增加1000倍以上)和信号响度(即使在时间为零时也增加3倍以上)方面表现出显著的改善。我们展示了为什么这种简单但未经探索的设计策略在未来仍然可以提供更强的性能，并且还可以增加空间分辨率和光声响应的定量线性，而不是扩展纵向成像。通过引入分子开关和转子来解决光声试剂面临的问题，这一实用策略将有助于释放光声成像在基础研究和转化应用中的全部潜力。
结果与讨论
设计、合成和光谱特性
我们的第一种方法是将苯基偶氮开关连接到Cy5/7荧光团上，在中间(M-AzCy5)或末端(E-AzCy5/7)。在第二种方法中，我们用偶氮苯取代了部分π系统，想象其N=N的共轭将最大化弛化速率。这就得到了偶氮半菁，具有2π体系长度的苯偶氮苯体系(P-AzHCy1/2)。与Nakamura一样，他使用噻吩偶氮桥进行红移，我们也测试了两种供体基团类型(T-AzHCy1/2)的噻吩偶氮。有趣的是，Swager曾建议使用这种支架进行PA成像，但可能是水溶性不足阻碍了它的应用。为了提高水的溶解度，我们还在wsT-AzHCy中添加了额外的磺酸盐。他们的合成是直接的。中间的苯基偶氮通过五甲基与苯重氮(M-AzCy5)反应而得到在不对称Cy染料合成(E-AzCy5/7)之前，末端苯基偶氮被安装到吲哚胺上。偶氮半菁胺由吲哚烯和醛(P/T-AzHCy1/2, wsT-AzHCy;)。这些染料的第一个要求是达到较强的近红外吸收，λmax需要> 720 nm才能在体内适用。中/端偶氮菁M/E-AzCys具有与参比五甲基wsCy5.5或七甲基ICG相似的吸收，但如预期的那样被展宽且强度较低。苯基偶氮-半花青素P-AzHCy型吸收为青色/绿色，因此不作进一步研究。令人欣喜的是，噻吩-半花青素型T-AzHCy在pa适应的近红外窗口中具有较强的吸收，T-AzHCy2的λmax为779 nm，与ICG具有直接的可比性;不过，与对称的Cy染料相比，它们的能带更宽，消光系数更低。
下一个要求是通过强制一个超短的S1状态来到达la类型的PA代理。低荧光是S1寿命短的必要但不充分的证据。T-AzHCy型在我们通常的设置中没有可检测的荧光;M-AzCy5几乎无荧光，但E-AzCy5/7的ΦFL与亲本几乎没有差异。偶氮苯可以发生E / Z光异构化，从而改变其吸收谱。对于定量测定PA造影剂，这样的变化是不可取的。我们测试了T-AzHCy类型，这些类型现在是我们的引线，在强LED照明下，它们没有改变Vis/NIR吸收，这是有希望的，但还不是结论性的。
光声信号的强度和光稳定性
我们现在测试了我们的假设，即具有快速S1→S0 VR的偶氮合并菁氨酸将具有强的光稳定光声信号。我们首先确定了PA的响应谱。令人高兴的是，T-AzHCys和M-AzCy在宽光谱范围内的PA比ICG强得多，尽管它们都是在相同的光密度下测试的:这表明它们的功能是LAs，而不是SA。对于理想的、定量的PA，光声响应谱应该与吸收谱相匹配:事实上，它们具有完美的光谱覆盖，这使得它们适合作为在一定波长范围内进行强、线性、定量PA成像的支架(图S3;SA ICG提供了一个反例，它们的光谱差异很大;导致其PA响应是非线性的和依赖于环境的)。
为了稳健地量化PA信号产生效率(SGE)，我们确定了PA- OD在0.1-0.5的整个OD范围内的拟合，所有物种的PA- OD都是线性的。令人高兴的是，wsT-AzHCy和T-AzHCy2是非常强的PA发射体，SGE大于ICG的3倍。M-AzCy5也是非常强的PA发射极;E-AzCy5/7的SGE最低，与ICG相似。值得注意的是，这些PA信号增强高达+220%，远远超过了纯荧光猝灭预期的+10%:支持每个脉冲多重激励的假设，这被认为是合并开关方法的一个完全普遍的优势。(由此推论:虽然单次激发后非辐射衰变的量子产率Φnr是使光声效率合理化的典型方式，但我们可以声明，增强的光声信号并不直接来自Φnr的增加，而是一种时间依赖性效应，因为连续可能发生多次激发)。在更多的生理条件下，即在血清和无有机共溶剂的情况下，AzHCy的光声性能比ICG的增强更大:wsT-AzHCy的SGE大于ICG的7倍。
与对称菁相比，这些特定的偶氮菁是带加宽的;因此，如果它们的SGEs按摩尔浓度归一化，它们较低的消光系数使它们的起始摩尔PA信号大约是花菁的1-2倍。然而，真正的挑战不是成像前的信号，而是随时间变化的信号。只有能够连续成像并积累高光子计数而不漂白的PA剂才能在体内成为有用的分子探针:否则，它们的信号不是定量的，但漂白不可预测地掩盖了真实的产物浓度。希望合并开关的超快松弛提供了增强稳定性的完全通用解决方案，我们现在在较长时间内测量PA信号轮廓，并使用典型的体内成像设置(即10mj /cm²，10ns脉冲宽度，10hz重复频率的激光脉冲;在这些设置下，每个切片的活体图像采集可能需要几秒到几分钟)。结果很好地支持了我们的LA设计原则。例如，在这些条件下，ICG的PA信号半衰期(t1/2)仅为4分钟，AzHCys根本不会漂白。只有使用它们的PA信号在30分钟内的标准误差作为总体高估，我们才能估计它们的漂白半衰期的最低可能范围:wsT-AzHCy >140小时，即比ICG稳定>1900倍;等电子T-AzHCy2类似。中间/末端连接的M-AzCy5/E-AzCy5/7的光稳定性也比它们的花青素同系物高10倍以上。优良的AzHCy光稳定性与血清一起保存。
这种直接获得AzHCy PA染料的方法比典型染料保持更大的信号强度，其数量级更长，这是我们设计的关键价值:因为它允许在整个生物学相关的分析时间尺度上定量而不仅仅是定性地解释信号强度。即使只聚焦于粗信号，AzHCys的3-7倍的SGE加上它们对光漂白的总抗性使它们超过了可光漂白ICG的更高消光系数，在几分钟的成像(即几帧或更少)内提供更高的摩尔PA信号。我们相信这些光稳定性和SGE的增强也将普遍适用于其他染料/开关家族，使当前的染料能够在长期成像中承受更高的脉冲能量，同时保持更高的信号强度:这对于成像低周转酶活性至关重要，通过积累定量和稳定的信号。
体内成像
光声学的主要目标是使体内实验成为可能。虽然本文的重点是提出一种新的化学概念，我们认为它可以改善许多染料类别的光声性能，但我们也希望在体内应用一种特定的示例染料(选择:wsT-AzHCy)，以测试超快弛豫是否能在PA中提供现实世界的可用性和实用性。我们的目标是评估沿着偶氮化设计开发的其他染料的重要概念特征:(i)在标准多光谱光声断层扫描(MSOT)期间，wsT-AzHCy的广泛吸收是否仍然允许将其信号从内源性发色团中分离出来;(ii)如果含二氮的染料在体内生物化学/ ADME中存活足够长的时间以允许实际使用(我们选择120分钟)，因为长时间存活是开发其长期光稳定性的必要先决条件;(iii)如果这种设计有希望适应分子显像剂，而不是局限于解剖染色。例如，如果染料与血清白蛋白永久结合，它的信号只会映射血液，使其成为解剖显像剂;但是，如果它在器官之间的分布不均匀，这就提供了希望，即存在重要的分子相互作用，这种相互作用可能会在以后通过衍生化进行调整，例如用于酶反应成像。
在健康成年小鼠尾侧静脉静脉注射wsT-AzHCy前和注射后2 h进行体内MSOT成像。选择横向图像切片来显示分子染料典型积聚的器官:肝脏，肾脏和脾脏。(i-ii)注射后2 h有较强的特异性wsT-AzHCy信号，注射前无特异性信号。因此，光谱解混可以成功地将染料从内源背景中分离出来，偶氮融合的染料在体内具有良好的存活时间。(iii) wsT-AzHCy信号在肠道、脾脏和肝脏有明确的生物分布，但在肾脏中不存在。这是分子可及性的一个有希望的指示，它可能在以后用于分子成像。
综上所述，这个概念验证实验为基于合并分子开关的光声造影剂在活体动物成像中的可用性提供了有希望的指示。
总结
生物学的巨大进步在很大程度上是由化学发色团推动的。荧光团可以很容易地实现活细胞酶活性的定量成像，几十年来，人们已经对荧光团进行了调整，例如用于体内浅成像。利用发色团的光声响应进行体内深部成像所需的设备和工程现在已经变得可行。然而，为了实现其在活体动物和临床环境中定量成像的承诺，我们必须超越重新利用像荧光团这样适应性差的造影剂:我们必须合理地开发光声发色团的化学设计策略，以适应PA的独特挑战和机遇。在这里，我们关注S1→S0寿命:PA造影剂性能最强大的光物理调节剂之一，但在化学上几乎被忽视。
我们发现，将分子开关合理地整合到NIR吸收支架中，可以使它们的S1→S0转变加速100倍以上。这使得PA信号的光稳定性提高了1000倍以上，同时也将即使是难以量化的“饱和吸收剂”发色团转化为“线性吸收剂”PA造影剂，在任意照明强度下，在任意长的成像时间内都可以可靠、稳定地量化。通过允许每个脉冲多个S0→S1→S0周期，AzHCy提供了一种简单的有机发色基团方法来增加PA信号响应:即使在目前的标准PA设备上，相对较长的脉冲设置围绕当前SA的弱点进行了优化，这些超快速松弛AzHCy剂在成像开始时已经提供了3-7倍的信号产生效率。然而，它们对激励强度的线性响应提供了利用更短但更强的激励脉冲来提供相同或更高的PA信号强度输出的机会，但具有更高的分辨率和更低的背景，这是目前没有NIR活性有机PA造影剂可以提供的。
从概念上讲，当我们开始这项工作时，我们没有找到一个可访问的分析框架，该框架将令人信服地向同事预测如何通过加速非辐射S1→S0衰减来不同程度地改善高性能PA必须平衡的多个性能特征:
(1)光稳定性和(2)任意设置下的信号响度，正如我们在这里报道的那样;还包括(3)信号响度、(4)信本比和(5)激励体素分辨率，它们都是激励脉冲时间和强度的函数。在论文修订期间，我们很高兴br & ndsted和Stains发表了预印本，参数化了声学响度因子(ALF = knr×ε)，正如我们所做的那样，现在明确优先考虑非辐射衰减率，其中线性吸收剂擅长指导PA染料优化(ALF对应于第2点，在我们的处理中任意设置的响度)。由于即使没有PA设备也可以直接可靠地确定ALF，因此我们认为ALF将证明比以前的参数化更有用，这些参数化仅适用于可饱和吸收剂，并且有针对性地研究死角，尽管ALF没有报告其他相关方面，如光稳定性、ISC和脉冲依赖效应。
实际上，由于这种合理的合并开关设计假设如此直接地成功，我们预测，在真正的一般意义上，重新控制分子开关将成为增强发色团的光物理决定的性能特征的有力途径。例如，非荧光azhcyys (T-AzHCy2超过900 nm，易于调节)的广谱近红外吸收使其成为理想的候选近红外荧光猝灭剂(另一种分子代表性不足的成像剂)，例如off→ON, NIR, FRET探针。PA还面临着其他的挑战，如设计其发色团的光物理和生物相容性，但我们相信它们也可以通过模块化的方式解决，可以与超快弛豫的好处协同作用。也许其中最重要的是引入酶反应的近红外/SWIR区域分子PA成像。在这方面，Schnermann的酶激活近红外花青素模板(CyBam)可能提供一个理想的模型系统，与这里开发的芳基偶氮花青素协同作用。我们相信，其他发色团类型，以及开关、转子和电机的其他化学类型的范围将足够广泛，足以为光声学及其他领域的创造性和谐提供动力。
参考文献
Merged Molecular Switches Excel as Optoacoustic Dyes: Azobenzene–Cyanines Are Loud and Photostable NIR Imaging Agents.Markus Müller, Nian Liu, Vipul Gujrati, Abha Valavalkar, Sean Hartmann, Pia Anzenhofer, Uwe Klemm, András Telek, Benjamin Dietzek-Ivanšić, Achim Hartschuh, Vasilis Ntziachristos, and Oliver Thorn-Seshold，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, e202405636, https://doi.org/10.1002/anie.202405636
