行业文献

内容提要

   我们开发一种光触发分子供体(NPCD565)的亚硝基过氧碳酸酯(ONOOCO₂)，这是我们所知的第一个此类供体，并进一步评估了其用于免疫治疗的可行性。NPCD565在紫外光到红光的广谱范围内照射后，ONOOCO₂与明亮的罗丹明染料(RD565)一起释放，其荧光是ONOOCO₂生成的定位、动力学和剂量的可靠和方便的内置报告。在4T1细胞中光解NPCD565后，观察到指示ICD的损伤相关分子模式(DAMPs)，并通过诱导树突状细胞成熟证实其具有免疫原性。在双侧荷瘤小鼠模型的体内研究显示，NPCD565对原发肿瘤具有强大的肿瘤杀伤能力，对远处肿瘤具有抑制生长的作用。

结果与讨论

NPCD565的设计与合成

   我们的分子设计部分受到了Nakagawa等人的原创作品的启发，他们报道了带有对羟基的n -亚硝化苯胺是ONOO供体。将这样的片段纳入罗丹明支架导致了PND的设计，预计它仍然是ONOO供体。在PND的叔苄基碳氢键上插入一个CO₂片段，完成了NPCD565的设计，这是第一个ONOOCO₂给体(见下文)。这种罕见的碳笼罗丹明NPCD565支架通过三步级联合成。以3,3′-双(二乙胺)-二苯基醚(1)为原料，在TiCl4催化下与2-氧-2-苯乙酸甲酯(2)缩合，以81%的收率制备了甲酯笼型罗丹明染料(3)。此外，3的脱烷基亚硝化得到4，产率为74%。在20%的氢氧化钠溶液中，以76%的收率将4的甲酯水解为NPCD565。为了制备PND530，我们从一种已知的rhodol染料开始(5)。5的COOH首先与MeOH缩合成甲酯(6)，甲酯进一步还原为其高总收率的白色形式(7)。7的苯胺部分在冷酸性条件下与NaNO₂亚硝化，得到产率为35%的PND530。化合物PND530被证明是一个光触发ONOO供体，并被用作NPCD565的光谱和生物学研究的对照化合物。

NPCD565的光化学性质

   在含0.1% DMSO的磷酸盐缓冲液(50 mM, pH=7.4)中评估NPCD565的光解。紫外/可见吸收在约300 nm处出现。400 nm以上可见光谱区的吸收最小。值得注意的是，在可见光范围内明显缺乏吸收并不一定排除存在低摩尔吸收率带，这是光化学活性的。然后，将NPCD565溶液暴露在365 nm的LED光下。在541 nm处出现了一个尖锐的吸收带。前60 s吸光度的增加基本上与照射时间成线性关系。然后，增长逐渐趋于平稳，可能是由于NPCD565的消耗。溶液在541 nm处激发后，观察到565 nm处的荧光发射带。发射增加的动力学剖面与从紫外/可见吸收光谱推断的相似。吸收/发射波段的形状/波长与罗丹明染料相似，经HPLC和HRMS证实为RD565。NPCD565的光解也可以被较宽光谱范围的光介导，例如400 nm、440 nm、520 nm、590 nm和640 nm。520 nm光特别有效，光解量子产率为6.0%(表S1)，此后用于体外和体内实验。通过光谱反卷积分析，NPCD565在可见光范围内表现出低吸收带(520 nm，约为102 cm 1 m1)。此外，NPCD565的光解动力学表现出明显的pH依赖性。在接近中性的pH下，NPCD565对可见光(如520 nm)具有高度响应，在实验条件下，其光解在1分钟内完成。然而，随着pH值的降低，光解效率显著降低，需要几十分钟。

   这些结果表明NPCD565的光解活性位点是C-COO键。然后用电子顺磁共振(EPR)研究了NPCD565光解过程中产生的自由基。以5,5-二甲基-1-吡咯啉n -氧化物(DMPO)为自旋阱，得到了由多种自由基组成的EPR谱。通过反褶积，确定了DMPO/CO₂ *加合物、DMPO/O₂ *加合物、氮氧化物自由基加合物和DMPO/R*加合物的存在。NO的释放由NO自由基清除剂2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑啉-3-氧化物-1-氧(PTIO)证实。

   我们进一步验证了NPCD565诱导酪氨酸硝化的能力，PND530作为对照。酪氨酸在3位的硝化作用被认为是ONOO形成的生物标志物。将l -酪氨酸溶液(50 μM)与NPCD565 (50 μM)或PND530 (50 μM)混合，520 nm照射后，用HPLC检测3-硝基酪氨酸的生成。EPR未观察到CO3 *。脱氧鸟苷(dG)的氧化谱证实了它的形成。dG是一种易氧化的富电子核苷酸。8-氧-7,8-二氢-2 ' -脱氧鸟苷(dOG)被认为是ONOO介导的DNA氧化的足迹。仅在CO3 的作用下，dOG进一步氧化为螺亚胺二乙酰胆碱(dSp)和5-胍基酰胆碱(dGh)。因此，dG的氧化谱是ONOOCO₂生成CO3 *的指示。我们将PND530 (ONOO供体，1 mM)和dG (1 mM)混合在无co₂的水介质中，并在520 nm照射下诱导PND530光解和ONOO生成。dG的氧化可以忽略不计，这与ONOO不氧化的事实是一致的。然而，当在CO₂饱和的培养基中进行时，得到的主要产物是dSp和dOG，以及少量的dGh，这表明ONOO的CO₂活化对于释放ONOO的氧化能力至关重要。

   然后，将NPCD565溶解于无CO₂介质中，用520 nm照射，得到的主要氧化物质为dOG，次要氧化物质为dSp和dGh。酪氨酸硝化和dG氧化分离出dOG、dSp和dGh，明确证实了NPCD565光解和下游二次NO₂和CO3 *在原位生成ONOOCO₂。

NPCD565的体外光解及氧化物质的释放

   测试了NPCD565体外生成ONOOCO₂的可行性。用NPCD565 (5 μM)和MitoTracker Deep Red孵育HeLa细胞，用520 nm激光照射指定时间。间歇获取绿色通道(RD565)和红色通道(MitoTracker Deep red)的荧光图像。在绿色通道中观察到NPCD565光解产生的RD565荧光。由于RD565与MitoTracker Deep Red高度共定位，证实其亚细胞定位为线粒体。RD565的平均细胞荧光强度与光照时间成正比，直至消耗NPCD565。在另一项实验中，将HeLa细胞与NPCD565和CellROX Deep Red一起孵育。RD565通道和CellROX Deep Red通道的荧光强度增加，这与NPCD565光解产生高氧化物质，即ONOOCO₂和次生自由基混合物一致。如果在辐照前用体外ROS清除剂n -乙酰半胱氨酸(NAC) (0.5 mM)预处理HeLa细胞，与不加NAC的细胞相比，CellROX深红通道的荧光增加将大大减少。因此，NPCD565可以在体外光激活释放ONOOCO₂和RD565。流式细胞术进一步证实了这些发现。利用ONOOCO₂的氧化能力和次生自由基混合物可以杀死肿瘤细胞。通过细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)检测，在4T1细胞和其他一些癌细胞系中评估NPCD565的暗毒性和光毒性。NPCD565 (10 μM)在黑暗中培养的细胞存活率为90%，表明NPCD565具有可忽略不计的黑暗细胞毒性(IC50 >38 μM)。然而，在npcd565孵育24 h前进行短时间照射，细胞存活率显著降低(IC50=2.5 μM)。NPCD565的高光毒性和低暗毒性突出了其光基癌症治疗的潜力。

4T1细胞中NPCD565光活化鉴定ICD标志及免疫应答

   ICD的免疫原性特征主要是由损伤相关分子模式(DAMPs)介导的，其中包括三个被广泛接受的标志，即钙网蛋白(CRT)暴露、高迁移率组盒1 (HMGB1)排放和ATP排泄。为了进一步确认npcd565诱导的肿瘤细胞死亡是否具有免疫原性，我们检测了ICD的三个标志。4T1细胞与NPCD565 (2 μM)孵育1 h，用520 nm激光(1 J/cm2)照射，再在黑暗中孵育12 h。为方便起见，该处理称为“NPCD565+hυ”。然后，对ICD的所有这三个标志进行评估。为了评估CRT暴露，接受“NPCD565+hυ”处理的4T1细胞是固定的，但不渗透。免疫荧光染色发现膜CRT的存在。从其他四组细胞，即空白，hυ， RD565和NPCD565中发现阴性结果。这些结果证实了NPCD565的光活化在CRT暴露中的关键作用。这种CRT易位作为“吃我”信号促进树突状细胞成熟。为了评估HMGB1的放电情况，将“NPCD565+hυ”细胞固定并渗透，对细胞核进行HMGB1的免疫荧光染色。只有“NPCD565+hυ”组细胞核区HMGB1表达减少。同时，ELISA法观察到细胞外上清中HMGB1表达增加。用化学发光法评估与ICD相关的ATP排泄。“NPCD565+ hυ”组细胞外上清液中ATP浓度比其他四组高2倍。细胞外ATP作为“找我”信号，诱导抗肿瘤免疫反应。通过用NPCD565照射4T1细胞鉴定ICD标志，我们进一步研究了这些DAMPs是否可以刺激免疫细胞，例如树突状细胞。从雄性C57BL小鼠的胫骨和股骨中分离未成熟骨髓来源的树突状细胞，并与接受“NPCD565+ hυ”处理的4T1肿瘤细胞共培养12小时。如果4T1细胞接受“NPCD565+ hυ”处理，高达45%的树突状细胞表现出CD80和CD86的共表达，这是成熟相关的标志物。反之，成熟树突状细胞所占比例则大大降低，为3.44-11.4%。树突状细胞成熟的加速证实了NPCD565是一种光触发ICD诱导剂。

NPCD565光解的体内肿瘤抑制和转移抑制

    我们首先验证了520 nm激光(20 mWcm^-2)对NCPD565的光激活在体内是可行的。然后，建立4t1 -异种移植BALB/c小鼠模型，评估NPCD565光解在体内的抗肿瘤效果。肿瘤接种后，约一周可使肿瘤体积达到约100 mm3。然后将4t1 -异种移植小鼠随机分为五组，包括四个阴性对照组，即(1)PBS， (2) hυ， (3) RD565， (4) NPCD565和光解组(NPCD565+hυ处理)。“NPCD565+hυ”组小鼠静脉注射NPCD565 (5 mg kg 1)，用520 nm激光(20 mWcm^-2, 10 min)照射肿瘤区域1 h。在16天的过程中，PBS和hυ组的肿瘤体积表现出快速增长，RD565和NPCD565组的肿瘤生长受到适度抑制。与之形成鲜明对比的是，在“NPCD565+hυ”组中，肿瘤生长基本停止。通过H&E染色和Ki-67抗体染色也证实了类似的治疗效果。与其他组相比，“NPCD565+hυ”组的存活时间最长。为了验证“NPCD565+hυ”治疗在体内是否具有免疫原性，我们分析了免疫细胞的激活标记，即树突状细胞、细胞毒性T细胞及其相关细胞因子的表达，包括穿孔素和颗粒酶b。通过流式细胞术检测“NPCD565+hυ”组肿瘤树突状细胞的成熟度。“NPCD565+hυ”组成熟树突状细胞百分比达到30.3%，显著高于4个阴性对照组。随后，通过检测细胞毒性T细胞(CD3+CD8+ T细胞)的百分比来分析肿瘤中CD8+ T淋巴细胞的丰度。CD8+ T淋巴细胞在肿瘤中的百分比(7.0%)也显著高于其他治疗组。免疫组化染色进一步证实CD8+ T细胞百分比升高。“NPCD565+hυ”处理后，CD8+ T细胞浸润到肿瘤中，CD8+ T细胞的穿孔素和颗粒酶B的表达分别增加了15.4%和12.0%。这一增幅明显高于其他治疗组。接受“NPCD565+hυ”处理的小鼠体重变化最小，并且没有明显的形态学变化表明“NPCD565+hυ”处理具有良好的安全性。

总结

   我们提出了一种光免疫治疗的后代自由基强化策略。设计了原位生成ONOOCO₂的机制，合成了ONOOCO₂的首个专用分子供体NPCD565，进一步证明了NPCD565是一种有效的光免疫原性药物。这种温和而强大的免疫原性反应物质(ONOOCO₂)的发现为研究免疫原性细胞死亡的生理机制提供了一个独特的视角，并为癌症治疗提供了一种干预策略。

参考文献

ACarbon-Caged Rhodamine Generating Nitrosoperoxycarbonate for Photoimmunotherapy， Lei Yin , Bei Zhao, Jie Zhou , Yunxia Huang, Hao Ma, Ting Zhou, Jie Mou, Peiru Min,*Jinquan Chen,* Guangbo Ge,* Xuhong Qian,* Xiao Luo,* and Youjun Yang，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202402949， doi.org/10.1002/anie.202402949