内容提要
缺氧是肿瘤的共同特征，在大多数癌症类型中与不良预后相关，因此具有明确结构的缺氧触发联合治疗系统在实现特异性和有效的肿瘤破坏方面具有重要前景。在这里，水溶性苝二亚胺(PDI)环烷“Gemini Box”(GBox-14+)被证明是一种缺氧反应光热剂和用于肿瘤特异性联合治疗的药物胶囊。首先，由于PDI发色团被双面分子带共价包裹，GBox-14+可以在缺氧肿瘤病变部位显著稳定生物还原产生的不稳定PDI自由基阴离子，从而实现肿瘤的高效近红外光热消融。同时，GBox-14+可以作为分子胶囊，以1:1的主客化学计量率结合水不溶性抗肿瘤药物喜树碱和羟基喜树碱，亲和性高，大大提高了药物的水溶性。这种载药环烷系统作为缺氧激活光热/药物联合治疗平台，在相同条件下比单一治疗更有效地抑制肿瘤生长。本研究显著扩展了主-客体环烷系统的应用范围，为开发结构均匀、特异性更高的抗缺氧肿瘤联合治疗剂开辟了一条有前景的途径。
采用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)法研究不同浓度GBox-14+对人肿瘤4T1和HeLa细胞的细胞毒性。结果表明，在1 ~ 125 μM范围内，GBox-14+对这两种癌细胞均无明显毒性，细胞存活率均>90.0%。正如Stoddart及其同事所观察到的[40-42]，这可能是由于GBox-14+的刚性盒状结构阻止了其插入DNA。利用电子顺磁共振(EPR)波谱技术探讨低氧肿瘤是否会诱发PDI•−。在缺氧条件下，4T1和HeLa细胞均可观察到明显的EPR信号，其值为2.0032，表明PDI•−的形成。此外，在缺氧条件下，PDI•−在728、816和973 nm处的特征吸收也出现了。一旦通风，EPR和PDI•−的吸收信号都迅速消失。这些结果表明，缺氧微环境是GBox-14+中PDI•−形成的决定性因素，这与之前报道的观察结果一致。为了评估触发PDI•−的光热性能，将GBox-14+ (0.1 mM)的缺氧4T1细胞以1.0 W cm-2的速度暴露在808 nm激光下，温度在10 min内可以从27.4℃明显上升到53.2℃，显示出明显的近红外光热效应。根据之前的方法，原位形成的PDI•−光热转换效率计算为4T1电池为33.1%，HeLa电池为30.5%。作为对比，无环参考PDI-ref4+也与低氧4T1细胞孵育，但在相同条件下，PDI•−几乎没有升温，近红外吸收可以忽略不计。因此，可以认为高浓度PDI•−的形成和稳定归因于GBox-14+中发色团的有效空间隔离。
采用4T1荷瘤小鼠，观察GBox-14+在肿瘤组织中的近红外光热活性。将4T1细胞皮下植入雌性BALB/c小鼠右背部，形成肿瘤异种移植物，使肿瘤生长至100-120 mm3体积。将GBox-14+溶液同时注射到肿瘤组织和正常组织的对侧相应位置。808 nm照射1 h后，10分钟内肿瘤温度迅速升高至63℃左右，周围组织无明显变化。相比之下，注射后的正常组织出现了边际温升(~41.6℃)。因此，PDI•−只能在缺氧肿瘤中通过原位生物还原而不能在正常组织中大量生成。我们系统地研究了其在体内对肿瘤的治疗效果。将4T1荷瘤小鼠随机分为4组:(1)生理盐水组，(2)生理盐水+激光组，(3)GBox-14+组，(4)GBox-14+ +激光组。根据细胞毒性结果，将注射GBox-14+溶液的浓度设定为100 μM。在原位注射100 μL溶液后，通过热成像监测相应的温度曲线，保留时间为60 min。GBox-14+处理小鼠的肿瘤区域在1.0 W cm-2的808 nm激光照射2 min后，温度从37.5°C快速升高到58.8°C，在照射10 min后最终维持在63.3°C，足以有效消融肿瘤组织。相比之下，1/ 3组的温度变化可以忽略不计，而2组的肿瘤在照射10分钟后仅表现出轻微的温度上升至~42.2°C。然后通过监测肿瘤体积来评估对肿瘤生长的治疗效果。数码照片显示，对照实验中，组1至组3的肿瘤生长迅速，说明GBox-14+或单独激光没有明显的抑制作用。与此形成鲜明对比的是，第4组的肿瘤被明显抑制，甚至完全消融。第4组小鼠的照片显示，热伤在13天内逐渐愈合，具有良好的生物安全性。考虑到缺氧条件下缺氧诱导因子(HIF-1α)高表达，采用HIF-1α免疫组化染色技术分析肿瘤缺氧状态。染色图显示，第4组的HIF-1α表达明显低于3个对照组，表明gbox -14++激光治疗后缺氧状态明显降低。此外，与对照组相比，第4组苏木精和伊红(H&E)染色的肿瘤组织表现出广泛的损伤。建立HeLa肿瘤裸鼠模型，进一步评价光热在体内的治疗效果。如图所示，gbox - 14++激光组也表现出显著的PTT活性，导致肿瘤消融彻底。同样，维持小鼠体重和主要器官的组织病理学图像显示出低系统性毒性，并伴有肿瘤中HIF-1α表达的正常化。因此，GBox-14+介导的缺氧诱导的特异性光热疗法不仅能有效抑制肿瘤生长，还能保证治疗小鼠的正常生理活动。光声成像(PA)作为一种非电离、无创的成像技术，因其融合了光学成像的高灵敏度和声成像的高穿透深度而备受关注。为了提高对实体肿瘤的敏感性和特异性，开发具有“开启”nir吸收能力的外源性缺氧激活PA探针是一项非常有意义的任务。由于PA成像基于光热转换，因此随后采用具有低氧响应近红外光热活性的GBox-14+在体内进行肿瘤PA成像。对携带HeLa肿瘤的雌性BALB/c裸鼠进行PA显像。GBox-14+ (50 μL, 100 μM)瘤内注射到肿瘤和对侧相应部位的正常组织中。60 min后，可见肿瘤区域PA信号相当显著。相反，在无缺氧微环境的正常组织中，没有检测到PA信号。因此，GBox-14+已被证明是体内实体肿瘤近红外PA成像的缺氧应答剂，可能为肿瘤治疗提供潜在的指导。
低水溶性是阻碍40%-70%新药应用的严重问题，将疏水药物包埋在水溶性大环宿主的空腔中是提高药物水溶性和生物利用度的一种强有力的超分子途径。为了探索GBox-14+作为结构明确的分子胶囊的可行性，我们选择了两种具有平面π共轭结构的抗肿瘤药物CPT和HCPT来评估GBox-14+的载药能力。首先，在加入过量的CPT或HCPT后，1h NMR谱显示GBox-14+有明显的信号移位，主客体复合物的整体面积显示出明显的1:1主客体封装。同时，通过M06-2X/6-31+G**方法进行结构优化，发现GBox-14+的平面CPT与PDI/联苯基团之间的π -π叠加相互作用可形成1:1的主客体配合物，分离距离约为3.4 Å。然后，通过荧光滴定，在H2O/DMSO (10:1, v/v)混合溶液中，CPT与Ka的结合亲和度为(8.33±1.51)× 105 M−1,HCPT与Ka的结合亲和度为(7.12±1.52)× 105 M−1。由于抗肿瘤药物的水溶性较低，阻碍了Ka值的测定，因此采用混合溶剂体系。因此，在纯水中的实际亲和力应该比测量值强。由于与Ka >105 M−1的结合亲和力被认为是足够的，因为在体内稀释和来自生物实体的竞争[48]，主-客体复合物可以防止药物泄漏，作为一种载药系统，这对储存注射给药至关重要。随后，以CPT为典型的水不溶性药物，研究GBox-14+对其溶解度的增强作用。该超分子前药通过简单的混合制备，在1:1的主客体化学计量中自发生成CPT≠GBox-14+，无需分离或纯化。在1.17 mM GBox-14+存在的情况下，以DMSO为参照，通过1h NMR积分，CPT的水溶性提高了约147倍。
为了验证CPT⊂GBox-14+与单独GBox-14+一样保留缺氧诱导的光热效应，首先在808 nm激光照射下研究肿瘤内注射CPT⊂GBox-14+后小鼠的热成像。在相对较低的0.5 W cm-2功率密度下，CPT∧GBox-14+照射10 min后，肿瘤温度从34.7℃升高到50.4℃，与单独照射GBox-14+的温度相当，而生理盐水组的温度变化可以忽略不计。这一现象说明CPT⊂GBox-14+在体内保留了产生热疗的光热转换能力，因此具有有效释放CPT同时杀死肿瘤细胞的潜力。为评价光热/化疗联合治疗效果，将具有相同4T1肿瘤模型的小鼠随机分为7组，给予以下治疗:(1)生理盐水，(2)GBox-14+，(3)生理盐水+激光，(4)CPT缩小GBox-14+， (5) CPT， (6) GBox-14++激光，(7)CPT缩小GBox-14++激光。注射60 min后，将3组、6组和7组的肿瘤区域暴露于808 nm 0.5 W cm-2激光下10 min。未进行激光照射的2组(GBox-14+)和4组(CPT fold GBox-14+)小鼠肿瘤体积稳定增长，与生理盐水组相似，说明在这些情况下没有抗癌作用。激光照射后，组6 (GBox-14++激光)由于PTT效应可以抑制肿瘤生长，但不能立即缩小肿瘤大小。相比之下，在相同条件下，7组(CPT⊂GBox-14++激光)的PTT/化疗联合治疗显示出比6组更有效的肿瘤抑制效果，证实了主客体系统的协同治疗效果。
总结
基于水溶性PDI环烷GBox-14+，开发了一种具有明确结构反应性的缺氧特异性主客体联合治疗系统。GBox-14+的共价连接双带结构有效地稳定了缺氧肿瘤原位产生的PDI自由基阴离子，从而实现了高效的PTT肿瘤消融。此外，GBox-14+可以通过宿主-客体相互作用在水中以高结合亲和力包封包括喜树碱在内的水不溶性抗肿瘤药物。作为PTT/药物联合治疗平台，在相同条件下，宿主-客体系统CPT⊂GBox-14+对肿瘤生长的抑制作用比单一治疗更有效。这项研究显著扩展了主客体环烷系统的应用范围，更重要的是，为结构均匀的联合治疗剂对抗具有缺氧特异性的肿瘤开辟了一条有前景的途径。未来的设计迭代可以将合适的偶联位点结合到这种生理稳定的功能结构基序中，作为下一代缺氧反应分子标签和/或药物胶囊进行生物偶联。
参考文献
Hypoxia-triggered photothermal/drug combination therapy of tumors using a perylene diimide molecular capsule Fei Yang, Guo Wang ,Kecheng Huang , Yanqing Xu*, Xiao Feng , Weizhi Wang* & Wei Wei*，Sci China Chem, 2024, 67, https://doi.org/10.1007/s11426-024-2231-1
