内容提要
荧光成像正在成为外科医生在术中成像中传统视觉检查的一种有前途的替代方法。传统探针在肿瘤诊断中缺乏准确性，难以准确描绘肿瘤边界。我们提出了基于肿瘤多维特征的“攻击系统(侵袭性肽酶)和防御系统(还原性微环境)”的攻防整合(ODI)策略，设计可激活的荧光探针精确成像肿瘤边界。从一系列基于ODI策略的探针中筛选出来，ANQ通过区分肿瘤细胞和正常细胞并最大限度地减少来自活体代谢器官的假阳性信号，比基于肿瘤单侧相关性的传统探针表现更好。为了进一步提高体内的信号背景比，我们制备了衍生的FANQ，并成功应用于小鼠模型和临床样本中原位肝细胞癌组织与邻近组织的区分。
结果与讨论
基于ODI策略的可激活探针的设计与合成
在肿瘤的“攻击系统”中，辅助肿瘤生长的氨肽酶N (aminopeptidase N, APN)不仅是研究最多的肿瘤相关蛋白酶，而且在正常组织(包括肝和肾)中也有活性。因此，基于单侧相关性的APN探针在到达肿瘤病变之前可能在正常组织中被激活，导致成像中肿瘤与正常(T/N)比较低。因此，我们选择APN作为具有代表性的肿瘤攻击肽酶来验证我们提出的概念。为了确保策略验证的实施，我们还选择了重要的肿瘤防御物质H2S、NTR和hNQO1。基于ODI策略，设计了一系列结合肿瘤“攻防系统”多维度特征的探针ANX (ANR、ANS、ANQ)用于肿瘤成像。此外，还合成了与ANX结构相似的控制探针ANP进行比较。这些基于ODI策略的探针ANX是由荧光报告基因(HD)和l -丙氨酸(APN的识别位点)串联与肿瘤防御触发基因(NTR、H2S和hNQO1)的识别位点建立的。另外，采用肿瘤单侧相关探针AN和NQ (Scheme S1b)作为参考探针。ANX探针(ANQ, ANR和ANS)的串联激活是在“防御者”和“攻击者”同时存在的情况下实现的。当两种触发点同时存在时，ANQ在708 nm处的荧光强度显著增强(15.8倍)，而ANR和ANS的荧光强度仅增强约3倍。相比之下，对照探针ANP与APN孵育后没有荧光增强因此，选择响应性能较高的ANQ作为后续体外实验的例子。ANQ的最大吸收峰红移至~686 nm，仅在肿瘤“攻防系统”相关生物标志物同时存在的情况下，~708 nm处的荧光发射逐渐增加。此外，当这些触发器被抑制时，这些变化就消失了。ANQ在~708 nm处的发射随APN (0 ~ 200 ng/mL)或hNQO1 (0 ~ 500 ng/mL)/ NADH (200 μM)浓度的增加而增强。
ANX探针用于活细胞共聚焦成像的评价
将基于ODI的探针ANX(包括ANR、ANQ和ANS)用于细胞内成像，以证明其在肿瘤成像中的潜力。通过用相应的抑制剂对细胞进行预孵育，也研究了ANX在细胞水平上的特异性。此外，与AN相比，ANP处理的癌细胞没有观察到明显的荧光。这些结果表明，ANX在细胞水平上的荧光变化是由肿瘤的“攻击系统”(侵袭性肽酶如APN)和“防御系统”(还原性微环境如H2S、NTR、hNQO1)诱导的。然后，ANX探针(5 μM)在不同细胞系中孵育1小时，不洗，然后共聚焦成像。值得注意的是，在一系列ANX探针中，多种类型癌细胞中的ANQ荧光强度明显高于各种正常细胞，这些结果也通过流式细胞术在几种具有代表性的细胞系中得到证实。此外，其他基于ODI的探针ANR和ANS在区分癌细胞和正常细胞方面表现出比AN更好的性能。此外，基于单侧肿瘤相关防御系统(肿瘤还原微环境)的hNQO1探针NQ也被用于细胞内水平验证，但癌细胞与正常细胞之间的比例较低。这些结果表明我们的ODI策略在细胞水平上是非常有效的。此外，在多种细胞系中发现ANQ的低细胞毒性。由于其良好的生物相容性、良好的准确性和高选择性，ANQ在后续的应用中得到了广泛的应用。利用荧光显微镜对经ANQ和相应抑制剂处理的MCF-7细胞进行时间依赖性分析，提示ANQ在肿瘤细胞中的适用性。所有结果表明ANQ在高精度肿瘤成像方面的潜力。
FANQ在肝癌小鼠体内的作用评价
肝细胞癌是一种发展迅速且严重损害肝功能的恶性肿瘤，手术切除是肝细胞癌的主要治疗策略。因此，为了降低肿瘤复发率，维持手术切除后肝脏的生理功能，需要高特异性、高精度的实时无创辅助手术工具。上述研究表明，FANQ只能在肿瘤的“攻击和防御系统”同时存在的情况下激活，可能是一种辅助HCC诊断和切除的潜在工具。应用FANQ检测小鼠皮下Hepa1-6(一种小鼠肝癌细胞系)的内源性APN和hNQO1。在将Hepa1-6细胞转移到小鼠体内之前，我们证实了ANQ在这些细胞中可以被激活。然后静脉注射FANQ给Hepa1-6荷瘤小鼠进行实时荧光成像。肿瘤的荧光在4小时内略有增强，在6小时达到最大。切除肿瘤和器官的实时活体成像和离体成像显示，肝脏和肿瘤组织的荧光信号明显高于其他器官，且FANQ的T/N比高于FAN。我们推测肝脏荧光信号的增强可能是肿瘤中探针激活后荧光产物代谢所致。根据图中FANQ的肿瘤富集结果，我们发现荷瘤小鼠肝脏的荧光强度在4 h内逐渐增加。正常小鼠肝脏未见明显荧光增强，主要脏器离体荧光图像也证实了这一点。这些结果表明，静脉注射的FANQ在到达肿瘤后转化为荧光团，并被肝脏代谢，进一步证实了我们关于荧光信号来源在肝脏的假设。此外，分别向Hepa1-6荷瘤小鼠静脉注射FAN或FANQ后，与FANQ处理小鼠相比，FAN处理小鼠的肝脏荧光更亮，进一步表明基于ODI策略的探针大大减少了正常组织对肿瘤特异性成像的干扰。此外，我们在皮下肿瘤喷洒FANQ后，通过手术导航获得了理想的效果。肿瘤切除前，经FANQ喷涂后肿瘤呈现明显的荧光。肿瘤切除后，再喷涂后残余病变呈现微弱的荧光。H&E染色也证实了切除的皮下肿瘤，表明荧光引导下肿瘤切除成功。综上所述，FANQ在肿瘤实时特异成像和手术切除方面的优异表现，相信FANQ在肿瘤边界精确成像方面具有更大的可能性。
小鼠模型和临床样本原位肝癌肿瘤边界的精确成像
受FANQ在皮下肿瘤成像中的优异表现启发，我们进一步将该探头用于肝脏原位肿瘤边界的可视化。首先，采用C57BL/6小鼠和Hepa1-6细胞建立原位肝癌小鼠模型。2周后，通过磁共振成像(MRI)监测模型的建立情况，用于手术计划或中期评估。随后，从小鼠身上切除Hepa1-6荷瘤肝脏，在其上均匀喷洒FANQ，荧光引导确定原位Hepa1-6肿瘤的边界。10min后产生强荧光，能准确描绘肝脏肿瘤边缘，与几天后H&E染色结果的病变和边界一致，说明FANQ在成像引导下的手术切除和肿瘤的快速病理检查中具有很大的潜力。相比之下，fan喷涂后的肝脏有多个区域的荧光增强，与H&E染色分析的肿瘤部位不一致。一些正常肝脏组织的荧光比肿瘤部位更强，但喷了fanq的肝脏却没有这种情况。因此，与基于肿瘤单侧相关的探针FAN相比，FANQ在原位肝癌肿瘤边界的精确成像方面具有优势。虽然不同HCC临床样本的T/N比率因个体宿主而异，但FANQ的T/N比率始终高于FAN。9组不同的小体积样品分别在FANQ或FAN中浸泡10分钟后进行荧光成像，结果相似。
总结
基于肿瘤持续存在所需的“攻击系统(肿瘤侵袭性肽酶)和防御系统(肿瘤还原微环境)”，提出了一种新的ODI策略，设计可激活探针，以避免假阳性信号，并提供实时术中辅助。为了验证这一概念，我们设计并合成了一系列基于ODI策略的探针(ANX和FANQ)，它们能够在高对比度下精确区分肿瘤细胞和正常细胞。值得注意的是，选择了具有高SBR的FANQ，并成功地应用于小鼠和临床样本的原位肝癌成像，与基于肿瘤单侧相关性的探针(FAN, T/N=1.65倍)相比，获得了更高的T/N比(3.29倍)。此外，FANQ不仅可以区分良性和恶性肿瘤，还可以通过清晰的荧光边界区分癌组织和邻近组织。因此，我们乐观地认为，这种基于肿瘤多维特征的创新ODI策略不仅可以有效地为高精度成像提供更多可激活的荧光探针，满足术中实时成像的需求，而且可以为荧光探针的设计和临床诊断带来新的见解。
参考文献
Dual-Locked Fluorescent Probes Activated by Aminopeptidase N and the Tumor Redox Environment for High-Precision Imaging of Tumor Boundaries， Yang Shen , Wei Li, Zhixuan Zhou, Junchao Xu, Yuhang Li, Haiyan Li, Xudong Zheng, Sulai Liu,* Xiao-Bing Zhang, and Lin Yuan*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202406332，doi.org/10.1002/anie.202406332
