内容提要
脑膜血管网络的高分辨率成像在神经学科的研究中具有重要意义，本研究开发了一种实用的方法，将完整脑膜在形态上完全展开并固定在琼脂糖凝胶中，借助高亮度聚合物点（Pdots）作为探针，对脑膜上的血管网络进行宏观和详细的成像。结果表明脑膜血管沿上矢状窦对称分布以及脑膜血管的分布具有层次性并且首次成像了小鼠中枢神经系统中的脑膜原始血管（Primo Vessels, PVs），其直径为4.18 ± 1.18 μm。此外，本研究证实了原位脑肿瘤的生长引起角膜新生血管的出现和视神经微血管的形态改变。本研究为脑膜血管相关疾病的后续研究提供了一种有效的基于Pdots的成像方法，并证明了眼睛可作为脑部疾病诊断的窗口。
结果与讨论
Pdots的制备和表征
根据实验需求，本研究以荧光共轭聚合物PFBT和PPV为发光中心，通过与配体PS-PEG-COOH共沉淀，合成了两种荧光发射不同PFBT Pdots和PPV Pdots。PFBT Pdots的最大紫外吸收峰和最佳荧光发射峰为378 nm和540 nm，水合粒径为63.44 nm，PDI为0.132，PPV Pdots的最大紫外吸收峰和最佳荧光发射峰分别为508和585 nm，水合粒径为75.24 nm，PDI为0.106。两种Pdots的Zeta电位值分别为−44.3 mV和−55.6 mV，具有优异的胶体稳定性。PFBT Pdots和PPV Pdots的荧光寿命分别为161.77 ns和89.61 ns，绝对荧光量子产率分别为94.2%和11.7%。而且，PFBT Pdots在可见光区域的荧光穿透深度达到2000 μm，因此选择其进行活体荧光成像实验。随后，评估了Pdots的荧光稳定性和粒径稳定性，两种Pdots分散在含有FBS的PBS和DMEM培养基中，水合粒径和Zeta电位值的变化较小，显示优异的粒径稳定性和胶体稳定性。此外，分散在FBS中的Pdots的荧光强度约为水的80%，下降趋势较小。总体而言，所获得的Pdots具有良好的荧光稳定性和物理稳定性。
脑膜血管的活体双光子成像
在静脉注射PFBT Pdots后对小鼠脑血管进行了成像，成像深度约为800 μm，其中深度为0-100 μm的血管分布稀疏，100-300 μm的深度可以观察到致密的血管网络，包括大血管和毛细血管，在300-500 μm的深度可以观察到一些毛细管网络。在上述不同深度的成像结果中，推测深度为0-100 μm的稀疏血管分布主要属于脑膜层。进一步分析了微血管的直径，测量结果为3.31 μm。同时，用PFBT Pdots对脑血管进行成像具有优异的信噪比，PFBT Pdots在血管内没有渗漏。
对含有脑膜和脑实质的组织切片进行Masson和HE染色实验，测得脑膜层厚度约为20 μm。将含有脑膜和脑实质的整个组织进行了组织清除并进行离体双光子荧光成像，可区分脑膜层和脑实质的血管信号，双光子成像测量的脑膜厚度为14-20 μm，与Masson和HE染色的结果一致。此外，组织3D成像结果和单张高分辨成像结果显示，脑膜内血管的血管密度小于脑实质的血管密度。在以往的报道中，脑膜和脑实质之间没有明确的界限，但在本研究中，体外组织的活体成像和双光子成像的结果都证实了脑膜血管和脑实质血管之间的差异，即脑膜血管的血管密度低于脑实质。
完整脑膜血管网络的高分辨率荧光成像
使用心脏灌注PFBT Pdots获得整体脑膜染色血管样本进行分析，结果显示脑膜上的血管沿上矢状窦（SSS）对称分布，SSS两侧的血管大多是树枝状的，并逐渐从尺寸较粗的血管分支到较细的血管。本研究获得了较为真实的脑膜血管结构信息，并且在脑膜上发现了原始血管（Primo vessels, PVs），PVs的起点在SSS处且沿SSS对称分布。PVs被证明是血管和淋巴系统之外的循环系统，在生物过程中发挥重要作用，包括组织再生、炎症和癌症转移。本研究的实验结果显示PVs的外周存在并行的管道，将其命名为PP-PVs。在PP-PVs分叉的地方，PVs也沿PP-PVs分叉方向分布，直至PP-PVs形成微血管网络，测得PP-PVs和PVs的长度约为2-2.5 mm，而且随着管道分支的出现，PP-PVs的直径逐渐减小，从160 μm逐渐减小至20 μm，然而PVs的直径呈轻微变化趋势，其直径为4.18 ± 1.18 μm。随后，对脑膜的微血管网络进行高分辨率成像和直径测量，结果为3.96 ± 0.89 μm。此外，基于多个样品测量了脑膜上的血管密度为68%，对血管进行分类，微血管网络约占32%，PVs约占17%。
进一步使用了光片显微镜获得了包括覆盖嗅球和小脑位置的完整脑膜血管3D图像。对脑膜血管进行了尺寸测量和统计分析，大多数血管尺寸在20-50 μm，较细的血管尺寸大小约为1-10 μm，血管的尺寸并不完全均一，但基本在150 μm以下。本研究对脑膜微血管网络进行高分辨率成像，为探索脑膜微血管网络异常是否会导致某些中枢神经系统疾病提供了研究方向。另外，本研究中也用小分子染料EB进行脑膜血管标记，结果显示Pdots可成像的脑膜血管密度明显高于EB，并且Pdots可以观察到脑膜上微血管的分布和PVs，而EB只能观察到尺寸较粗的血管，没有观察到PVs。而且EB成像的信噪比为20，低于Pdots样品，证实了Pdots用于成像微血管的效果更佳。
原位脑肿瘤鼠眼微血管的荧光成像
静脉注射PFBT Pdots后，正常鼠的虹膜血管规则排列，但肿瘤鼠的眼血管分布混乱，存在明显的分层现象，分别是虹膜血管和角膜血管。通常在正常情况下，角膜没有血管，而本研究中的实验结果表明脑肿瘤导致了角膜新生血管的形成，并测得的角膜新生血管直径为5-25 μm，说明了眼脑微血管的密不可分的关系。此外，正常鼠的视神经血管比肿瘤鼠致密，探针在正常小鼠的视神经微血管网络中均匀分布，在肿瘤小鼠的视神经微血管中分布不均匀。推测脑肿瘤引起视神经微血管通透性的变化，从而影响血液-视网膜屏障并导致探针从微血管中泄漏。
脑膜血管周围间隙的荧光成像
脑膜血管周围间隙（Perivascular Spaces, PVS）是脑脊液引流的重要通路。
视神经类淋巴系统的荧光成像
本研究中，将PFBT Pdots应用于眼NaOH碱烧伤疾病模型的成像，以探索视神经类淋巴系统的结构和功能变化。脑池注射PFBT Pdots和PPV Pdots心脏灌注后，对眼球和视神经进行解剖、固定和荧光成像。结果表明，PFBT Pdots信号主要以散射斑点的形式分布在视神经外表面，属于类淋巴系统。由于PPV Pdots是通过灌注方式注射到小鼠体内的，其主要分布在视神经内的血管中。此外，NaOH组视神经外表面PFBT Pdots的荧光强度明显高于正常组。NaOH组视神经外表面PFBT Pdots荧光强度主要在100 a.u-160 a.u，正常组为70 a.u-110 a.u。两组PPV Pdots荧光信号强度在30 a.u-50 a.u。这是由NaOH碱烧伤角膜会引起一系列炎症反应，激活眼类淋巴系统，导致PFBT Pdots信号在视神经外积累更多。
脑膜淋巴管的活体荧光成像
本研究中，将具有高量子产量的PFBT Pdots注射到小鼠的侧脑室，可以在荧光条件下对淋巴管和淋巴结的轮廓和位置进行成像，结果显示脑膜淋巴管主要平行于血管。离体组织的免疫荧光染色实验证实了上矢状窦和横窦附近的PFBT Pdots都能够与PDPN和Prox-1共定位，说明了PFBT Pdots成像小鼠脑膜淋巴管的可行性。此外，本研究中使用PFBT Pdots来探索脑膜上血管和淋巴管的分布，SSS附近的淋巴管和血管处于平行位置，注入脑池的PFBT Pdots充满脑膜淋巴管内部，而心脏灌注的PFBT Pdots主要存在于脑膜的血管中，不能进入脑膜淋巴管，说明脑膜淋巴管和脑膜血管在结构分布上是相对独立的循环系统。
总结
本研究获得了小鼠完整脑膜背血管的高分辨率成像，然而缺乏腹侧脑膜血管的影像学和分析，这是因为小鼠腹侧脑膜附近存在多对颅神经，如视神经、嗅神经等，使得小鼠腹侧脑膜在解剖学上难以完整。此外，尚未确定Primo vessels对脑膜的功能研究及其表达的特定标志物，Primo vessels已被证明是血管和淋巴系统以外的循环系统，但其在中枢神经系统的生理或病理条件下的功能尚未得到详细的解释。本研究开发了一种实用的方法，将完整脑膜按照其自身的弧形状态固定在琼脂糖凝胶中，可以保证脑膜完全扩张。使用方便且经济的立体荧光显微镜来获得出色的成像效果，降低了实验成本。与以前的报告相比，观察到脑膜血管更详细的信息，脑膜上的血管密度为68%，且沿着上矢状窦对称分布。此外，本研究发现原位脑肿瘤会引起角膜新生血管和视神经微血管结构变化。
综上所述，本研究获得了高分辨率的小鼠脑膜血管分布图谱，这在以前的研究报告中尚未报道，其研究成果对未来脑膜血管相关疾病的研究将具有较重要的参考意义和价值。值得一提的是，本研究首次对小鼠中枢神经系统中的原始血管进行了成像，这可能是未来脑膜淋巴血管网络研究的重点。另外，本研究中重点关注脑肿瘤的眼部微血管变化，为脑部疾病的预防和诊断提供了新的窗口。
参考文献
Fluorescent Pdots Facilitate High-Resolution Mapping of the Intact Meningeal Vascular Network and Eye−Brain Connections Yuqiao Li, Shuting Lu, Zhuang Zhang, Xiaoyan Li, Yankun Li, Xiaowei Li, and Liqin Xiong*. ACS Nano. 2024 Aug 5. doi: 10.1021/acsnano.4c05333.
