内容提要
基于单分子的一刀切光疗被认为是一种方便的癌症治疗方法，其疗效依赖于通过多模态成像精确定位病变，再加上光疗的有效发挥。为了释放光疗的全部潜力，光疗剂和光传递方法的进步是必不可少的。本文首次提出了将具有聚集诱导发射特性的多功能分子tBuTTBD与改性光纤相结合，实现原位乳腺肿瘤综合诊断和“由内而外”照射的集成策略。由于其强烈的给受体相互作用、高度畸变的构象、丰富的分子转子以及聚集后松散的分子间堆积，tBuTTBD在激光照射下可以同步进行第二次近红外(NIR-II)荧光发射、光热和光动力产生，形成了NIR-II荧光-光声(PA)-光热成像引导的三模态光疗。在插入通过将平端光纤与空芯光纤拼接而成的改性光纤后，进一步进行肿瘤治疗。这种配置旨在通过最大限度地利用能量来实现有效的原位光疗。这项工作不仅丰富了NIR-II光治疗药物的调色板，而且为探索实际癌症治疗的综合光治疗方案提供了有价值的见解。
结果与讨论
分子设计和光物理性质研究
叔丁基取代二苯胺作为强电子给体，位阻己基噻吩作为bridge和附加电子给体，高吸电子性的苯并双噻唑作为强受体，从而构建了化合物tBuTTBD。其中，叔丁基取代的二苯胺的螺旋桨状构象、叔丁基的位阻以及己基噻吩的长烷基链共同扭曲了整个分子骨架，这不仅通过显著减少分子间的堆叠和与水的相互作用抑制了聚集过程中的荧光猝灭，而且为分子内运动提供了足够的空间。有利于非辐射热能的衰减。此外，沿tBuTTBD的强D-A效应有望减小电子带隙并改善ISC过程，从而产生色移吸收和发射波长以及良好的光动力势。利用紫外-可见-近红外光谱和荧光光谱对tBuTTBD分子的光学性质进行了表征。tBuTTBD在THF中的最大吸光度在812 nm处，最大发射峰出现在1088 nm处。tBuTTBD的发射峰如此之长，是由于D-A相互作用异常强，并且延伸了conjugation，很好地符合分子设计的概念。然后通过分析不同水馏分(fW)的THF/water混合物中的FL光谱来研究tBuTTBD的AIE特征。tBuTTBD在纯四氢呋喃溶剂中由于分子内运动占主导的能量消耗而表现出相当微弱的发射。随着fW的增大，由于分子内运动(RIM)效应的限制，tBuTTBD的发射强度逐渐增大，呈现出典型的AIE特征。为了使tBuTTBD具有水分散性和肿瘤靶向性，采用纳米沉淀法，以两亲性聚合物DSPE-PEG2K和DSPE-PEG2KMal为载体分子制备AIEgen NPs。随后，用iRGD修饰NPs表面，以其深入肿瘤以增强治疗目的的能力而闻名。动态光散射(DLS)测量显示，tBuTTBD NPs-Mal和tBuTTBD NPs-iRGD的水动力尺寸分别为62.41和67.14 nm。水动力尺寸的差异证实了iRGD在NPs表面的成功附着，zeta电位的显著差异进一步证实了这一事实。计算出tBuTTBD的包封效率≈90%。此外，tBuTTBD NPs-iRGD在H2O、PBS和培养基溶液中保持吸光度和大小超过6天，表明其储存稳定性高)。tBuTTBD NPs-iRGD的吸光度最大值为808 nm，发射峰为1092 nm，与THF中的tBuTTBD相似。tBuTTBD NPs-iRGD表现出优异的光稳定性，在连续激光照射30分钟后，吸收光谱的变化很小，比aunr和ICG更健壮。这样的特性是令人满意的光驱动生物应用。AIE效应使tBuTTBD NPs-iRGD的荧光量子产率比商用IR-26染料(0.5%)高0.8%，有利于NIR-II荧光成像。进一步得出NIR-II FL强度与NPs浓度之间的线性关系，可以大致反映NPs的生物分布。
在808 nm激光照射下，评价了tBuTTBD NPs-iRGD的光热效应。在0.4 W cm−2的低功率密度下，tBuTTBD NPs-iRGD在50 μM的温度下实现了16°C的温升。热转换效率为58.9%，超过了大多数报道的光热剂。此外，通过改变808 nm激光的功率密度和tBuTTBD NPs-iRGD的浓度，可以很好地调节tBuTTBD NPsiRGD的光热性能，这表明tBuTTBD NPs-iRGD具有很高的光热转导灵敏度。将tBuTTBD NPs-iRGD与商用光热剂、aunr和ICG进行比较，进一步评估其光热稳定性。该评估包括对样品进行连续六次激光照射和自然冷却循环。tBuTTBD NPs-iRGD的光热谱在每个循环中几乎不变且可逆，与aunr和ICG的退化谱形成鲜明对比。由于tBuTTBD NPs-iRGD具有良好的光热性能，我们进一步研究了其光热性能。tBuTTBD NPs-iRGD的PA光谱与吸收光谱匹配良好，峰值在808 nm附近。得出了PA强度与AIEgen浓度之间的线性关，并验证了良好的PA稳定性，显示了其在体内PA成像和半定量分析方面的巨大潜力。在808 nm激光照射下，tBuTTBD NPs-iRGD也取得了良好的光动力学效果。2 '，7 ' -二氯二氢荧光素(DCFH)检测总ROS的产生。在tBuTTBD NPs存在的情况下，激光照射(0.4 W cm−2)下，DCFH的荧光明显增强，表明其具有良好的ROS生成能力。这样的生产速率优于商用光敏剂Ce6。并用电子自旋共振(ESR)谱分析了活性氧的类型。tBuTTBD NPs-iRGD在激光照射下产生的活性氧主要是羟基和超氧自由基。额外的光动力学特性使tBuTTBD成为协同癌症治疗的有效光疗剂。
光纤辐照光热响应研究
利用改性光纤辐照tBuTTBD NPs-iRGD的光热响应。温度增量随着激光功率和tBuTTBD浓度的增加而增加，与准直器辐照后的tBuTTBD NPs-iRGD光热分布图相似。但是，需要注意的是，经过改性光纤辐照10 min后，样品的最高温度始终略低于相同激光功率为300 mW和NPs浓度的准直器所达到的最高温度。在热成像系统下进一步仔细观察发现，在准直仪的激光照射下，仅在样品的上半部分产生了大量的热量。与之形成鲜明对比的是，在改性光纤的激光照射下，样品溶液中实现了均匀产热。另外用小鼠皮肤和鸡胸组织作为光屏障来模拟体内的热生成。首先用小鼠的皮肤盖住样品的溶液表面，以阻挡“由外而内”的辐射。由于采用“由内向外”的辐照方式，改性光纤所引发的光热响应完全不受影响。相反，由于严重的光衰减，使用准直器辐照的样品的温升明显降低。鸡胸组织作为另一种光屏障来模拟小鼠的生物组织。准直器组在样品表面盖上厚度为1mm的组织层。在光纤组中，将一根改性光纤插入直径为1mm的圆柱形组织内。还应该提到的是，环氧树脂的表面涂层可以增强光纤的韧性，增加光纤的生物相容性，便于体内光热治疗。从热红外图像来看，光纤组的性能仍然优于准直器组。这些结果显示了改性光纤在光热治疗中的巨大潜力。此外，还通过改性光纤考察了tBuTTBD NPs-iRGD的光动力学效应。NPs可以产生明显的ROS，这也比Ce6更有效。
细胞摄取、细胞毒性测定和体外光疗
利用iRGD肽赋予tBuTTBD NPs肿瘤靶向能力。通过流式细胞术分析评估不同浓度的4T1细胞对tBuTTBD NPs和tBuTTBD NPsiRGD的细胞摄取，以评估其靶向能力。由于tBuTTBD的NIR-II发射与流式细胞仪的检测波长范围不匹配，tBuTTBD NPs和tBuTTBD NPsiRGD都与20%的DPTA-BT(我们之前的工作设计的高发射AIE分子)共负载。细胞的平均荧光强度(MFI)随着NPs浓度的增加或iRGD的存在而增加。tBuTTBD NPs- irgd的靶向能力在更大的NPs浓度范围内得到了进一步证实(基于tBuTTBD的NPs浓度范围为1 ~ 50 μM)。共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)显示，tBuTTBD NPs- irgd比tBuTTBD NPs表现出更强的红色荧光，表明4T1细胞更有效地摄取细胞。此外，NPs发出的红色荧光与LysoTracker green的绿色荧光重叠，在合并的图像中产生黄色斑点。红色箭头表示的区域的强度线轮廓显示，红点和绿点之间的直径相当，表明内吞作用是细胞摄取的原因。然后使用各种途径抑制剂通过流式细胞术分析评估内吞途径。由于氯丙嗪(网格蛋白介导的内吞抑制剂)和制霉菌素(囊泡/脂质介导的内吞抑制剂)可以在4°C下有效地抑制细胞摄取效率，因此观察到NPs的能量依赖性内吞过程。而且氯丙嗪的抑制作用比制霉菌素更有效，表明其主导途径是网格蛋白介导的胞吞作用。
随后使用4T1细胞评估tBuTTBD NPs-iRGD的体外光疗效果。首先，将4个细胞系(4T1、293T、HS578bst和GL261)与tBuTTBD NPs-iRGD孵育12或24 h，以评估暗细胞毒性。在不同NPs浓度和孵育时间下，所有被研究细胞的存活率均达到87%以上，表明tBuTTBD NPs- irgd具有良好的生物相容性和可忽略的暗细胞毒性。然后在tBuTTBD NPs-iRGD存在的情况下，用输出功率为300 mW的808 nm激光诱导4T1细胞进行体外光疗。通过准直器的常规照射方式，同样输出功率为300 mW, tBuTTBD NPs-iRGD即使在相对较低的浓度(小于10 μM)下也能有效抑制癌细胞的生长。将小鼠皮肤进一步覆盖在培养板上，模拟光疗过程中的光屏障。在这种情况下，通过准直器触发的tBuTTBD NPs-iRGD的治疗效果明显减弱，即使在50 μM的高浓度下，仍有超过62.1%的细胞存活。与此形成鲜明对比的是，经过修饰的光纤可以忽略皮肤对光线的阻碍，从而保持tBuTTBD NPs-iRGD的强大疗效。Calcein-AM/PI双染色进一步证明了不同浓度、不同条件下照射tBuTTBD NPs-iRGD的治疗效果。在准直器的激光照射下，几乎所有的细胞都被根除，出现了强烈而大量的红色荧光。由于小鼠皮肤阻挡了入射光，大量的绿色荧光仍然存在，这表明tBuTTBD NPs-iRGD的治疗效果急剧减弱。这些结果同时证明了tBuTTBD NPs-iRGD的良好治疗效果，并突出了改性光纤的优越性。
通过不同处理后的4T1细胞Annexin V-FITC/PI检测，进一步阐明细胞死亡机制。在没有tBuTTBD NPs-iRGD或接受tBuTTBD NPs-iRGD但没有激光照射的组中，几乎所有的4T1细胞都保持活力。这表明所有的光传递方法和NPs本身具有足够的生物相容性，可以避免不必要的细胞损伤。通过准直器引入光疗后，4T1细胞出现了早期和晚期凋亡，当AIEgens浓度为50 μM时，晚期凋亡占细胞死亡模式的97%以上。当小鼠皮肤阻挡准直器的激光时，这种细胞凋亡被大大削弱。然而，改性后的光纤可以避免皮肤的光阻塞，并诱导99%的晚期细胞凋亡。
肿瘤的多模态成像和体内光疗
由于tBuTTBD NPs- irgd具有出色的多功能性，我们对荷瘤小鼠进行了多模式成像，包括NIR-II FLI、PAI和PTI，以研究静脉注射后NPs的生物分布。肿瘤部位的荧光强度在前24小时内明显增加，随后由于组织代谢的原因出现轻微的衰减。可以注意到，在注射NPs后，肿瘤血管被很好地区分开来。直径为2.2 μm和3.6 μm、信本比为7.5和6.6的血管清晰可见，显示出良好的NIR-II光成像质量。然而，在注射后24小时，这些血管变得无法区分，并且在肿瘤区域观察到荧光增强，表明tBuTTBD NPs-iRGD的渗透和保留(EPR)作用增强。注射后36 h，收集小鼠主要器官和肿瘤进行NIR-II成像。肿瘤仍能发出明亮的荧光，证实了tBuTTBD NPs-iRGD对肿瘤组织具有良好的靶向能力。由于tBuTTBD NPs- irgd具有显著的光热作用，我们对NPs注射后的荷瘤小鼠进行了PAI和PTI实验。肿瘤部位PA信号在前24 h逐渐增强，随后12 h略有衰减，这种强度动态与NIR-II FLI观察到的强度动态相似。此外，在注射tBuTTBD NPs-iRGD后5分钟，通过PAI可以很好地区分肿瘤血管系统。对于PTI，用808 nm (300 mW)激光照射小鼠，并通过热像仪监测。在激光照射后注射12 - 36小时观察肿瘤部位的有效治疗温度。综上所述，多模态成像结果不仅证实了tBuTTBD NPs-iRGD的肿瘤靶向能力，还提示了进行光疗的合适时机。然后将tBuTTBD NPs-iRGD作为光疗剂用于肿瘤治疗。携带4T1肿瘤的BALB/c小鼠随机分为五组:VI组:PBS组;7: tBuTTBD NPsiRGD;VIII: PBS加近红外激光器，经改性光纤;九:tBuTTBD NPs-iRGD加近红外激光通过准直器;X: tBuTTBD NPs-iRGD加近红外激光器，通过改进的光纤。在治疗期间进行单次静脉给药，然后在注射后12 h进行单次激光照射(808 nm, 300 mW, 10 min)。在VIII组和X组中，修饰后的光纤穿透肿瘤，平均深度为5mm。当激光打开时，整个肿瘤都被照亮了。超声成像显示修饰后的光纤在肿瘤内的空间位置。值得注意的是，X组肿瘤部位出现了强烈的温度升高，最高温度为54℃，而IX组的最高温度为50℃。将改性光纤插入肿瘤，可以有效地避免皮肤和健康生物组织的光衰减。
治疗完成12天后，处死所有小鼠，收集肿瘤进行组织学分析。肿瘤切片的苏木精和伊红(H&E)染色清楚地表明，近红外激光(IX组和X组)激活的tBuTTBD NPs-iRGD可引起局部高温和ROS对肿瘤组织的严重损伤。这导致肿瘤细胞排列松散，空洞明显增加，核固缩明显。相比之下，VI-VIII组肿瘤细胞密集排列。tdt介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光染色进一步证实了tBuBBTD NPsiRGD存在的近红外激光照射小鼠肿瘤组织中存在严重的细胞凋亡。此外，IX组和X组几乎没有ki67阳性增殖细胞和cd31阳性血管形成信号，进一步揭示了有效的光疗效果和肿瘤抑制生长。阴性对照组(VI-VIII组)出现大量细胞增殖和血管生成，形成鲜明对比。采用大视场对肿瘤进行组织学分析，研究光疗的死亡机制。未经光热和光动力处理的肿瘤细胞(VI-VIII组)增殖良好，可见广泛的ki67阳性绿色荧光。在通过准直器的激光诱导光疗(IX组)的情况下，肿瘤的外部区域没有表现出任何Ki67荧光信号。相反，预计接受较少激光照射的肿瘤内部部分仍保持Ki67阳性。值得注意的是，在整个视图中，X组的所有细胞都没有ki67阳性的绿色荧光。这些结果再次凸显了改性光纤在克服光穿透限制、实现更大光疗空间方面的优势。
总结
总之，这项工作阐明了一个综合的策略，使充分的光治疗潜力在原位乳腺癌治疗。成功设计了一种多模态光疗AIEgen，即tBuTTBD，它在具有强D-A关系的高度扭曲的分子骨架上同时实现了高效的分子内运动和部分RIM，从而显示出808 nm处的最大吸收、1092 nm处的最大发射、优异的PA信号、突出的光热响应和令人满意的ROS生成等许多迷人的特征。将tBuTTBD NPs配制成NPs并经iRGD修饰后，根据NIR-II FLI-PAI-PTI的三模态成像观察到tBuTTBD NPs-iRGD在肿瘤部位的优先积累。为了实现无生物组织光阻塞的原位激光传输，通过将平端光纤与空芯光纤拼接，制备了一种能有效漫射光的改性光纤。因此，在改性光纤引导下，tBuTTBD NPs-iRGD在激光照射下对原位乳腺肿瘤小鼠进行了高效彻底的光疗。这项工作是将多模态NIR-II发射AIEgen与间质光纤结合用于癌症治疗的第一个例子，并将在临床试验中引发光疗的最新发展。
参考文献
Interstitial Optical Fiber-Mediated Multimodal Phototheranostics Based on an Aggregation-Induced NIR-II Emission Luminogen for Orthotopic Breast Cancer Treatment Wenguang Zhang, Miaomiao Kang, Xue Li, Hao Yang, Zhijun Zhang,* Zhuorong Li, Yibin Zhang, Miaozhuang Fan, Changrui Liao, Chengbo Liu, Gaixia Xu,* Dong Wang,* Zhourui Xu,* and Ben Zhong Tang*，Adv. Mater. 2024, 2406474
