内容提要
原代神经细胞的实时成像对于监测神经元活动至关重要，特别是具有良好生物相容性的多尺度和多功能成像。多尺度成像可以提供从纳米尺度到毫米尺度的细胞结构和功能的见解。多功能成像可以监测大脑的不同活动。然而，由于缺乏具有高信本比、水溶性、多尺度和多功能成像能力的染料，这仍然是一个挑战。在这项研究中，我们提出了一种具有近红外(NIR)发射(>700 nm)的神经染料，可以在不到1分钟的时间内实现对初级神经元成像的超快速染色。该染料不仅可以实现从神经突、神经膜、单个神经元到全脑的多尺度神经活细胞成像，还可以实现突触囊泡和膜电位变化的监测和定量等多功能成像。我们还探索了这种近红外神经染料在脑切片和活脑染色方面的潜力。与商业染料相比，近红外神经染料与神经膜的结合性能更好，从而实现了多尺度和多功能的脑神经成像。总之，我们的发现通过开发一类小分子染料，在神经成像染料方面取得了重大突破。
结果与讨论
近红外染料用于神经成像
与神经胶质膜和内皮细胞膜相比，近红外TTVP对神经膜具有更强的亲和力。通过与商业膜染料(DiI)共染色，评价了近红外神经染料的膜定位能力。为了评估共定位，在用DiI孵育神经元10分钟后，我们将近红外神经染料在培养基中培养1分钟。共定位成像证实了近红外染料在膜上的选择性积累，如合并图像所示。近红外神经染料与DiI的合并图像表明，近红外神经染料对神经元膜具有良好的特异性。我们通过表征它们重叠的程度来评估这两种荧光染料的共定位，因为每种染料都有自己的发射波长。我们分别采用单独染色和共染色方法，评估了NIR神经染料和DiI在不同时间点对神经元的染色稳定性。与神经元孵育1 min后，近红外神经染料可以染色神经膜，而DiI只能染色胞体的部分。结果表明，该神经染料具有优异的膜定位能力，适合于超快染色(小于1 min)。为了研究这两种染料对神经元的长期染色稳定性，我们分别将染料与神经元孵育10分钟。荧光图像显示，近红外神经染料可以特异性染色神经膜，而DiI几乎可以浸润所有神经元。
纳米尺度下突触囊泡的监测
我们使用共聚焦显微镜监测突触囊泡。共定位图像显示，近红外神经染料可以染色突触囊泡并监测突触囊泡的运动。近红外神经染料与FM4-64的合并图像表明，近红外神经染料对突触囊泡具有良好的结合能力。我们监测了21 min内神经突内突触囊泡的变化，并测量了不同时间点的突触大小。统计结果表明，突触囊泡在0.5 ~ 1 mm范围内分布明显。随着时间的推移，小突触囊泡的数量减少，而大突触囊泡的数量增加。间隔21分钟后，0.5 - 1 mm范围内的突触囊泡减少了50%以上，而2 - 2.5 mm范围内的突触囊泡比初始数量增加了一倍以上。这一观察表明了一种纳米级现象，即神经突中的小突触囊泡倾向于聚集并形成更大的突触囊泡。可形成突触囊泡库，参与突触刺激时神经递质的释放。我们监测突触囊泡的数量，它们在12分钟时增加并达到峰值。这些结果表明，近红外神经染料可以监测神经突的变化和突触囊泡，为研究中枢神经系统纳米级神经元间的接触提供了有价值的见解。
探索神经膜电位动力学
与商用染料FluoVolt相比，NIR神经染料显示出更高的信噪比(SNR)。基于先前的研究，我们通过计算暴露于KCl和多巴胺刺激时的信噪比值，进一步评估了近红外染料和氟伏染料的信噪比定量分析结果表明，在不同的化学刺激条件下，与氟伏染料相比，近红外神经染料具有更高的信噪比。近红外染料在KCl刺激下的信噪比为20，是氟伏染料的3倍。近红外染料的信噪比为30，是多巴胺刺激下氟伏染料的1.5倍。由于近红外染料的亲水部分带有两个正电荷，其与神经膜的结合会随着去极化和超极化而变化，从而引起荧光强度的变化。
脑成像探索
我们使用先前文献中的方案实现组织透明，使完整脑组织的荧光成像成为可能。近红外神经染料有效染色神经元。为了评估近红外神经染料特异性标记神经元的能力，我们使用免疫荧光染色来标记脑切片中的神经元和内皮细胞。脑切片的免疫荧光图像和共定位分析显示，这些区域被近红外神经染料变亮，并且与Tuj1特异性标记的神经突区域强烈重叠，而与cd31标记的内皮细胞区域没有重叠。这些结果表明，近红外神经染料对神经元染色具有良好的特异性。我们还通过将染料注射到小鼠体内并通过动物和离体成像监测其在大脑中的分布来评估染料的血脑屏障(BBB)渗透性。定量分析表明，近红外神经染料可以进入并停留在大脑中，表明其在脑部诊断中的潜力。
总结
近红外神经染料显示出对活神经元的多功能成像能力，能够监测神经突中的突触囊泡和膜电位的动态变化。对近红外神经染料对脑切片的染色能力也进行了评价。我们的研究结果表明，近红外神经染料可以结合膜结构，特别是突触囊泡。这种结合亲和性有助于在纳米级精度上精确量化神经突中的囊泡数量和大小。此外，该染料可以实现多尺度成像，包括神经突囊泡、神经膜、单个神经元和整个活脑。这种染料可以监测膜电位的变化。它可以与神经元生理电活动的实时监测无缝集成。总之，NIR神经染料具有出色的生物相容性和超快染色(1分钟内)，并且能够长期和多尺度实时监测电信号。这种染料有很大的潜力完全取代植入的神经电极，促进神经系统的生理功能和病理生理的未来探索。近红外染料允许多尺度成像，从纳米级的神经突突触囊泡到宏观级的神经膜、单个神经元甚至整个大脑。在未来，它可以用来探索突触传递和可塑性的机制。这种染料在无创神经成像和增强对神经系统生理功能和病理生理的理解方面具有巨大的潜力。
参考文献
Coupling Nanoscale Precision with Multiscale Imaging: A Multifunctional Near-Infrared Dye for the Brain, Xiaoyan Liu, Yao Chen, Chen Hang, Jinxiong Cheng, Dinglu Peng, Ying Li,* and Xingyu Jiang*,ACS Nano 2024, 18, 22233−22244,https://doi.org/10.1021/acsnano.4c06103
