内容提要
本研究提出了罗丹明型染料类似物(Rh824, Rh926和Rh1029)的多烯桥接策略，用于调谐来自第一个近红外窗口(NIR-I;750−900 nm)到前所未有的第二个近红外窗口(NIR-II;1000−1700海里)。磷脂酰胆碱(PC)外壳的染料提高水溶性和三倍的荧光量子产率。代表性的NIR-II荧光团Rh1029-PC在进行体内血管成像时，其空间分辨率明显高于NIR-I荧光团Rh824-PC。我们构建小鼠血管出血模型，首次在NIR-II窗口应用Rh1029-PC作为血管造影剂。图像显示NIR-II窗口出血位置的清晰度更高，表明混合罗丹明衍生染料在NIR-II荧光生物成像中的成功应用。
多烯桥接的杂化罗丹明-奔驰[c,d]吲哚类似物Rh824, Rh926和Rh1029的合成路线见支持信息简而言之，苯并[c,d]碘化吲哚(化合物I)与N,N ' -二苯甲酰胺反应生成化合物II，并在酸酐中缩合与化合物III偶联。最终产物NIR-I染料Rh824的总收率为~ 50%。基于类似的合成过程，Rh926的产率为~ 41%。然而，上述Rh1029合成序列的总产率仅<10%。荧光团分别在824、926和1029 nm处显示最大吸收，在872、975和1093 nm处显示最大发射。吸收最大值在~ 100 nm处，与每个乙烯桥单元的增量一致肩吸收的存在可能是由于罗丹明基杂化染料的非共价二聚化每个荧光光谱大致反映了吸收，并具有峰值斯托克斯位移约50−60 nm。多烯桥成功地将混合罗丹明-苯[c,d]吲哚类似物的排放物转移到生物透明区，其中Rh824落在NIR-I区，而Rh926和Rh1029出现在NIR-II区。我们使用市售IR1061 (ΦFL = 0.53%)作为荧光光度计来获得这三种染料的相对量子产率。计算得到Rh824、Rh926和Rh1029的量子产率分别为1.30%、0.76%和0.33%。
我们选择两亲性磷脂酰胆碱(PC)使亲脂分子溶于水。染料通过疏水-疏水相互作用将自己嵌入多层磷脂中，酸性尾部锚定在磷脂酰基链的组装中通过改变合成温度、染料与PC的比例和反应时间，优化了Rh824-PC、Rh926-PC和Rh1029-PC包封染料的量子产率。最佳配方含有Rh1029:PC的摩尔比为~ 1:5。36 .基于该配方，Rh824-PC、Rh926-PC和Rh1029-PC的量子产率分别为2.72%、1.95%和1.27%，是溶解在二氯甲烷中的染料的三倍这种量子产率的增加可能是由于PC的疏水性烷基链对荧光团的空间分离，但基于基态电子吸收，很难得出明确的结论，这需要未来的研究。通过动态光散射(DLS)测定，Rh1029-PC的平均尺寸为~ 100 nm。我们还尝试了其他策略，包括聚乙二醇化，包埋在二氧化硅或聚苯乙烯(PS)基质中，或包封牛血清白蛋白(BSA)以溶解水溶液中的染料。然而，发现PC在提高整体荧光量子产率方面是最有效的。我们进一步通过连续激光照射测试了自组装纳米囊泡的光稳定性。Rh1029-PC在1100 nm和Rh824-PC在880 nm照射1 h后荧光发射没有变化，具有良好的光稳定性。与此形成鲜明对比的是，fda批准的ICG和ICG- pc在水中835 nm处测量的荧光明显下降。我们选择Rh824-PC和Rh1029-PC进行以下体内生物成像，比较两个近红外窗口的成像质量。
裸鼠静脉注射1.0 mM Rh824-PC或Rh1029-PC溶液进行体内血管成像。5 min后处死小鼠，在NIR-I或NIR-II生物显像仪上采集荧光信号。我们在功率密度为10 mW cm - 2的情况下筛选了后肢血管图像的最佳成像区域。NIR-II成像仪配备不同的长通滤光片(1100nm、1200nm和1300nm长通)采集不同的荧光波长区域。Rh824-PC在NIR-I窗口中毛细管区域的低信噪比影响了血管宽度的准确测定。与之形成鲜明对比的是，使用Rh1029-PC的NIR-II窗口中的血管图像要清晰得多，这要归功于更低的自动荧光背景噪声。根据图像中绘制的线的发光强度进行高斯拟合利用高斯峰拟合(λem≥1100 nm)在股骨血管区域测量的半最大值全宽度(FWHM)，血管宽度为0.35 mm。另外两个发射收集窗的股骨血管宽度分别为0.31 mm (λem≥1200 nm)和0.27 mm (λem≥1300 nm)。我们剥去裸鼠的皮肤，在同一位置测量股骨血管的准确宽度。血管宽度为0.30 mm，与图中数据拟合得到的血管宽度一致。因此，本研究选择λem≥1200nm区域的最佳成像通道作为体内成像的最佳通道。它同时保持了低的自身荧光和精细的图像细节。该区域的分辨率计算为0.131 mm。λem≥1100 nm区域的图像具有较高的背景干扰，λem≥1300 nm区域的图像遗漏了部分毛细血管，两者都较差。我们根据图3E和3F所示红色虚线的校准曲线计算血管宽度。NIR-I区的高自身荧光导致血管信号曲线难以区分，从而抑制了腹部血管细微结构的成像。相比之下，Rh1029-PC实现了血管的高分辨率成像，包括平行股动脉和毛细血管。分布在腹部的血管巢甚至在肝脏附近也能被区分出来。
总结
我们得到了混合罗丹明-奔驰[c,d]吲哚类似物(Rh824、Rh926和Rh1029)，其吸收峰范围为824 ~ 1029 nm，发射峰范围为872 ~ 1093 nm。显着的色移归因于连接罗丹明型荧光团和苯并[c,d]吲哚的多烯桥。这种分子设计可以通过模块化地取代π结构或所需的吸收或发射波长的桥，潜在地扩大近红外荧光团的类别。我们证明了磷脂酰胆碱是一种装载Rh1029等水不溶性染料的良好载体，并提高了荧光量子产率。Rh1029-PC具有良好的光稳定性和较大的Stokes位移，在NIR-II生物窗口中表现出优异的成像质量。体内血管成像显示Rh824-PC和Rh1029-PC在近红外成像中具有高分辨率和低背景的优势。作为实际应用的例子，我们利用Rh1029-PC初步成像处理技术构建了血管出血模型，并成功定位出血区域。我们相信，我们开发的用于调节混合罗丹明基染料波长的分子设计方法将大大扩展NIR-II荧光团的新类别。我们的通用荧光团设计策略为充分研究多功能混合罗丹明染料提供了一个机会，可以在NIR-II窗口中作为高分辨率体内生物成像的强大荧光显像剂。
参考文献
Development of Polyene-Bridged Hybrid Rhodamine Fluorophores for High-Resolution NIR-II Imaging， Yibing Shi, Wei Yuan, Qingyun Liu, Mengya Kong, Zhenhua Li, Wei Feng, KeHu,* andFuyou Li， ACS Mater. Lett. 2019, 1, 418−424 ，DOI: 10.1021/acsmaterialslett.9b00265
