内容提要
细胞的生存、生长和分化在很大程度上依赖于外源营养的摄取。然而，在单细胞水平上量化小分子营养物质的摄取是困难的。我们提出了一种新的方法来研究营养吸收在活的单细胞使用逆电按需Diels Alder (IEDDA)化学。我们用四嗪修饰了羧基荧光指示酸琥珀酰酰酯(CFSE)——一种猝灭的荧光团，可以与蛋白质共价反应，并且只在酯酶活性后的细胞胞浆中被激活。该四氮作为第二猝灭剂，用于悬垂的荧光团。在IEDDA反应中，当与富电子修饰的营养物或张力的亲二烯试剂反应时，该猝灭基团被破坏，从而使探针能够发出荧光。这使我们能够使用流式细胞术和活细胞显微镜监测活的原代免疫细胞群中各种含双嗜酸菌的营养物质的摄取。
结果与讨论
我们在分子中引入猝灭四氮将使该结构满足最后一个要求，因为这些是吸收峰在500-550 nm之间的强猝灭部分，允许基于Forster共振能量转移(FRET)的悬垂荧光团猝灭，或通过使用刚性连接剂进行共轭，通过基于透键能量转移(TBET)的机制。当iedda与应变烯烃连接时，这些猝灭特性就会丧失，从而导致高达11000倍的荧光开启。我们设计了两个fret淬灭的CFSE变体(，以及一个带有刚性间隔的变体，该变体也允许tbet2介导猝灭(1，方案1)。探针1 (CFSE- tz)使用Devaraj报道的原位Heck交叉耦合方法构建，将甲基四嗪连接到荧光团。首先，合成了与t-丁基修饰羧基和甲酰基同时功能化的四嗪(化合物9)。从商业4-三苯甲酸开始，经过2步以51%的收率得到四嗪8。在DCM中，8与MsCl和TEA发生甲酰基化反应，得到两种化合物，一种是甲酰基化的四嗪9，另一种是共轭烯烃10。
我们在0.1% DMSO/PBS中评估了所有四嗪荧光团的吸收-发射光谱。吸收最大值在493 nm和498 nm之间，而最大荧光发射在515 nm和527 nm附近检测到。这些值与CFSE本身相似(492/517 nm)。然后我们测量了荧光素酯水解和/或IEDDA反应后探针是否具有荧光性。当在探针4和1中加入猪肝酯酶(PLE)时， 4的荧光强度提高1.5倍，1的荧光强度提高6倍。轴向TCO-OH(18)单独加入到4、6和1中，对任何探针都没有产生荧光增加。在每个探针上依次添加PLE和18确实导致最终产物的荧光增加20倍，其中1 (CFSE-Tz)， 27倍酰胺“最终产物”-模拟物17。
本文用二吡啶基四嗪进行了反应性测试，得到了反应速率最快的四嗪类化合物的反应速率常数为2*103 M-1 s-1。因此，我们的假设是，17与CpQ反应的速度太慢，在我们的系统中无法检测到。。我们接下来评估探针1的毒性。用1处理HeLa细胞30分钟，清洗2次，孵育2、5、24小时。在这些时间之后的MTT分析表明，与对照相比，在所有测试浓度(高达50 μM。在随后的实验中，我们只在浓度等于或低于此值时使用1。接下来，我们评估了是否可以使用1来监测HeLa细胞对营养物质的摄取。我们首先用2 μM的探针在37°C下孵育细胞半小时，加载1。细胞在含血清的培养基中孵育5分钟(与剩余的hosu -酯反应)后，清洗细胞2次，加入浓度为2 μM的22个细胞。分别在t=0、15分钟和30分钟测量每口井的MFI。观察到信号随时间增加，30分钟后达到饱和。在4°C时，没有观察到背景吸收，表明该过程依赖于能量。为了确定检测限，我们用不同浓度的1孵育细胞，然后在淬火和洗涤后，用250 μM的22溶液孵育30分钟。小额信贷确实增加了1。我们还改变22 (2 μM至250 μM)的浓度，用2 μM的1孵育后，显示30分钟后荧光浓度依赖性增加。用50 μM的1培养细胞30分钟后，再加入250 μM的营养物质，效果最好。接下来，测试所有其他iedda活性营养素。将hela细胞与1在50 μM下于37°C孵育30分钟，在淬灭和洗涤后，与我们的文库中不同的生物正交营养物质在250 μM浓度下于37°C孵育30分钟。与其他生物正交营养物质相比，聚糖25和26的吸收率最高，环丙烯修饰的营养物质的信号最低。CpQ(27)在背景上没有产生可检测的信号。
由于IEDDA是一个高速率常数的活细胞兼容反应，我们接下来研究了探针1 (CFSE-Tz)作为伪实时摄取探针的潜力，仅受摄取后营养物质反应速率的限制。为此，我们再次以50 μM / 1预孵育HeLa细胞，但不是通过流式细胞术测量摄取，而是在平板读取器中测量荧光出现(482-15/530-20 nm)。没有接受营养的细胞仍然没有荧光，而所有含烯烃营养物质的摄取和结联(CpQ除外(27))随着时间的推移，信号显著增加，其中TCO产生的信号出现得最快。由于TCO修饰的营养物质的快速速率，我们开始研究观察到的荧光增强速率中哪一部分是由于营养物质的摄取速率，哪一部分是由于iedda反应的细胞内速率。因此，我们用250 μM of 22对1预染色的HeLa细胞孵育10分钟。
在加入新鲜的HBSS溶液之前，将多余的22洗去两次。20分钟后未见信号增加，>80%的营养物去除后信号出现在15分钟内。这些数据证实了该试验对活细胞营养摄取研究的适用性。此外，我们评估了利用共聚焦显微镜研究活细胞营养摄取的可能性。HeLa细胞用1预染色，用22或24打开荧光团。然后通过活细胞显微镜每分钟拍摄一张图像来跟踪营养物质的摄取。随着时间的推移，22和24的信号都增加了，但当没有添加可点击的营养物质时信号没有增加，这表明成像实验的过程不是由于自身荧光。这些结果表明，信号的增加是由于营养物质的吸收。在将1作为一种研究单细胞营养吸收的新方法的适用性期间，1的背景是一致的。
总结
我们提出了一种新的双条件荧光探针1 (CFSE-Tz)，并展示了它在监测各种生物正交营养类似物的吸收方面的应用，包括氨基酸、脂肪酸和n -乙酰甘露糖胺的类似物。在添加营养物质之前，将荧光前体预先加载到细胞中，使我们能够监测这些营养物质的摄取情况。然而，这种方法有一些局限性。首先，由单元中发生的点击反应引起的15分钟延迟限制了方法的时间分辨率。此外，尽管基团比悬挂的荧光基团小得多，但iedda反应基团仍然可以代表相当大的体积，特别是在反式环烯基反应基团的情况下。如果精确的摄取速率是研究中的关键参数，我们因此建议较小的环丙烯基团是有利的，特别是在脂质研究中。此外，根据我们在之前的研究中观察到的情况，“甲硫氨酸类似物”叠氮同质丙氨酸通过谷氨酰胺转运体Slc1A5进入细胞，强烈建议确定正在研究的细胞系统中每种生物正交修饰摄取的确切效果。尽管存在这些局限性，但我们确实认为，这一首次尝试以一种原则上在体内兼容的方式向活细胞实时营养摄取提供了对免疫代谢工具包的有价值的补充，因为它将使我们能够比较复杂人群，这将提供关于(免疫)细胞可用的营养物质的实际局部浓度如何影响其后续行为的第一个指示。
参考文献
ABioorthogonal Dual Fluorogenic Probe for the Live-Cell Monitoring of Nutrient Uptake by Mammalian Cells，Yixuan Wang , Diana Torres-García，Thijmen P. Mostert, Luuk Reinalda, and Sander I. Van Kasteren*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202401733 ，doi.org/10.1002/anie.202401733
