行业文献

内容提要

    准确、灵敏的近红外(NIR)发光侧流免疫分析法(LFIA)在医疗现场检测(POCT)领域引起了广泛的关注。然而，近红外荧光探针的荧光量子效率低(<10%)，往往会影响检测的准确性和灵敏度。本文报道了由聚苯乙烯(PS)纳米粒子和最大发射波长为830 nm (AIE₈₃₀)的近红外发光原(AIEgen)组成的超亮近红外AIEgen纳米粒子(PS@AIE₈₃₀NPs)，并描述了其促进LFIA精确、灵敏检测复杂样品的潜力。PS@AIE₈₃₀NPs的相对量子产率(QY)为14.76%。PS@AIE₈₃₀NPs免疫标记的LFIA与实验室自制的NIR-LFIA便携式定量仪器(检测光范围> 800 nm)相结合，完全消除了背景干扰，无需任何预处理步骤即可实现高精度、高灵敏度检测。酱油中的黄曲霉毒素B1 (AFB1)、关节液中的金黄色葡萄球菌生物标志物α溶血素(Hla)和人溶血样品中的c反应蛋白(CRP)的检出限(lod)分别为0.01 ng mL^{- 1}、0.02µg mL ^{- 1}和0.156 mg L ^{- 1}，与相应的金标准法相符，覆盖了感兴趣的检测范围。

结果与讨论

NIR-AIE纳米颗粒的合成与表征

    为了获得高QY NIR-AIE荧光纳米粒子，我们首先以苯并双噻二唑为受体，甲氧基tpe为电子给体，设计并合成了名为AIE₈₃₀的nir发射aigens。通过1H NMR、13C NMR和高分辨率质谱对AIE₈₃₀的结构进行了表征。研究了AIE₈₃₀在四氢呋喃(THF)/水混合物中聚集后的荧光变化。结果表明，AIE₈₃₀的荧光(FL)强度随着THF中水的比例从0%增加到90%，从332.7 a.u.急剧增加到5743 a.u.，具有典型的AIE特性。不同条件下的吸收光谱也显示了AIE₈₃₀分子的聚集特性。随着fw的增大，吸光度逐渐降低，说明AIE₈₃₀在THF/水混合物中发生了聚集沉淀。这些结果证实了AIE₈₃₀的成功合成。为了在LFIA平台上应用，采用有机溶剂溶肿法将AIE₈₃₀包封在300 nm的PS纳米颗粒中，制备亲水性NIRAIE荧光纳米颗粒(PS@AIE₈₃₀NPs)。本文选择300 nm的PS纳米颗粒作为AIE₈₃₀染料的载体，因为这种特定尺寸的信号探针对于构建高灵敏度的LFIA平台是有利的，我们选择了1mg AIE₈₃₀染料基PS@AIE₈₃₀NPs进行后续实验。扫描电镜(SEM)显示，所得PS@AIE₈₃₀NPs具有较高的均匀性和单分散性。为了比较不同包埋方式对FL强度的影响，我们进一步采用聚马来酸酐- α -1-十八烯(PMAO)聚合物自组装包埋方式包埋AIE₈₃₀。随着AIE₈₃₀反应浓度从8 mg增加到16 mg，所得PMAO@AIE₈₃₀NPs的FL强度逐渐增加，相应的粒径从180 nm增加到360 nm。考虑到夹心LFIA检测探针的最佳粒径在300-350 nm之间，我们选择360 nm PMAO@AIE₈₃₀NPs作为比较样品。此外，还使用fda批准的近红外染料吲哚菁绿(ICG)基荧光纳米颗粒(PS@ICGNPs)作为对照样品。结果显示，PS@AIE₈₃₀NPs (488.8 a.u.)的FL强度显著高于PMAO@AIE₈₃₀NPs (117.6 a.u.)和PS@ICGNPs (206.2 a.u.)，说明使用PS作为载体可以显著减少AIE₈₃₀的用量，优于传统的聚集猝灭近红外染料。以ICG (QY = 4.1%)为参比(激发波长为680 nm)测定PS@AIE₈₃₀NPs (1 mg AIE₈₃₀)的相对QY。PS@AIE₈₃₀NPs显示出14.76%的超高相对QY，是报道的基于近红外染料的荧光纳米颗粒中QY最高的。此外，PS@AIE₈₃₀NPs的吸收光谱(670 nm ~ 710 nm)和发射光谱(829 nm ~ 832 nm)相对于AIE₈₃₀略有红移，表明甲氧基tpe具有较强的给电子能力。纯PS纳米颗粒未观察到明显的荧光发射峰。通过建立AIE₈₃₀的紫外-可见吸收标准曲线，我们计算出AIE₈₃₀在个体PS@AIE₈₃₀NPs中的数量为5.47 × 10⁵。此外，PS@AIE₈₃₀NPs的水动力直径与PS相似，其多分散性指数(PDI)为0.082，表明载染后PS纳米颗粒没有聚集或破裂，具有良好的单分散性。这些结果表明成功合成了具有高QY、亲水性和单分散性的近红外荧光纳米粒子。

PS@AIE₈₃₀NPs抗干扰能力

    为了验证开发的PS@AIE₈₃₀NPs可用于准确诊断复杂样品中的目标，我们验证了它们对吸收、自身荧光和光散射的抗性。选取酱油、关节液和溶血样品进行检测。使用绿色、黄色和红色发光CdTe量子点作为比较参考。酱油、关节液和溶血样品在400-700 nm处有很强的吸收。在365 nm氙灯激发下，在400-700 nm范围内也观察到酱油、关节液和溶血样品的高自身荧光上述复合样品的强吸收和自身荧光直接覆盖了量子点的激发和发射光谱，但在>700 nm后，两者在近红外区均显著降低至40和76 a.u.。为了验证配合物样品对量子点和PS@AIE₈₃₀NPs荧光强度的影响，我们将这些发光材料直接加入稀释的配合物样品中。结果显示，与水溶液中的强度相比，不同复合物样品中绿色、黄色和红色发光量子点的FL强度明显降低。其中，在酱油中，绿色、黄色和红色发光量子点的荧光强度分别下降了94.0%、94.8%和97.5%。在关节液中，相应的降低幅度分别为94.4%、94.2%和95.0%。在溶血样品中，绿色、黄色和红色发射量子点的还原率分别为98.2%、98.0%和94.0%。相比之下，复合样品对PS@AIE₈₃₀NPs近红外发射的FL强度几乎没有影响，这表明吸收、自身荧光和光散射的干扰可以完全消除。

不同样品对荧光微球的影响

   考虑到复合样品对可见光有很强的猝灭能力，我们还分别在测试条上加入水和不同浓度的酱油、关节液和溶血样品后，评估了可见光(400-700 nm)和近红外(>800 nm)区域的FL强度。当不同浓度的酱油滴在试纸上时，与空白和浇水的试纸相比，试纸的颜色明显不同。在680 nm激光(800 nm长通滤光片)的激发下，不同酱油样品处理的测试条与空白测试条类似，几乎没有荧光信号。然而，空白和水处理的测试条在365 nm LED灯(390 nm长通滤光片)的激发下表现出明显的自身荧光和光散射荧光，而酱油处理的测试条由于其深色吸收激发光而表现出明显的黑点。在不同浓度的关节液和溶血样品处理试纸时，观察到类似的FL强度结果。此外，我们进一步验证了PS@AIE₈₃₀NPs消除测试条上的吸收、自身荧光和光散射干扰的能力。PS@AIE₈₃₀NPs首先固定在试纸上，加入生物样品后测量FL强度。CdTe量子点和PS@ICGNPs作为比较参考。可以看出，分别加入酱油、关节液和溶血样品后，PS@AIE₈₃₀NPs-immobilised试纸的FL强度没有变化。在PS@ICGNPs-immobilised试纸上加入酱油、关节液和溶血样品，也得到了类似的结果，表明近红外光可以显著降低复杂样品的干扰。而绿色、黄色和红色发光量子点的荧光强度完全消失。以上结果表明，NIR-emitting PS@AIE₈₃₀NPs完全消除了复杂样品的吸收、自身荧光、光散射等干扰，显著提高了信噪比，提高了检测灵敏度，保证了检测结果的精度。

PS@AIE₈₃₀NPs-labeled LFIA在复杂样品诊断中的应用

    制备的PS@AIE₈₃₀NPs作为信号探针，提高了免疫层分析法诊断酱油中一类致癌性真菌毒素AFB1的灵敏度和准确性。图中展示了抗AFB1抗体与PS@AIE₈₃₀NPs的偶联路径，以及PS@AIE₈₃₀NPs-immunolabeled单抗体竞争LFIA快速、灵敏、准确检测AFB1的检测原理。我们先将30µL的酱油样品直接加入到70µL的上样缓冲液中，然后将其置于试纸孔中。在AFB1存在的情况下，它首先与抗AFB1抗体修饰PS@AIE₈₃₀NPs[46,47] (PS@AIE₈₃₀NPs@aAb反应，形成免疫复合物(PS@AIE₈₃₀NPs@aAb-AFB1)。通过毛细管作用，PS@AIE₈₃₀NPs@aAb-AFB1没有与固定在试验系上的整个抗原(BSA@AFB1)结合(T线，酱油样品中的AFB1占据了抗体的结合位点)，而是被固定在对照线上的山羊抗小鼠IgG (C线)捕获。这导致T线上没有荧光带，C线上没有荧光带。相反，在缺少目标AFB1的情况下，PS@AIE₈₃₀NPs@Ab探针与BSA@AFB1反应并固定在T线上，多余的PS@AIE₈₃₀NPs@aAb探针继续与山羊抗小鼠IgG反应。这导致T线和C线上都有荧光带。反应完成后(10 min)，用实验室自制的便携式近红外试纸条检测器测量T线和C线的荧光强度，并用自编软件对数据进行处理，计算T/C线荧光强度的比值。为了获得更好的检测性能，对免疫反应时间和PS@AIE₈₃₀NPs@Ab浓度进行了优化。最优参数组合如图所示。在最佳条件下，使用PS@AIE₈₃₀NPs-immunolabeled试纸条监测AFB1标准品加入酱油样品(0 ~ 1000 ng mL⁻¹)。结果显示，随着AFB1浓度的增加，T线荧光带逐渐减弱，说明LFIA检测呈现出明显的浓度依赖定量关系。图中展示了T线荧光强度与AFB1浓度的关系所得到的PS@AIE₈₃₀NPsbased试纸的校准曲线。开发的LFIA的LOD(定义为空白平均FL强度加上三倍标准差)和一半最大抑制浓度分别为0.01和2.23 ng mL⁻¹，低于酱油的国家限量(5 ng mL⁻¹)，而线性范围为0.01 ~ 1000 ng mL⁻¹，覆盖了酱油的检测范围。此外，通过分别检测浓度为0、0.1、5和50 μ g L⁻¹的afb1添加酱油样品进行回收率测定。标准曲线计算的检测浓度与加标浓度基本一致，加标回收率在90% ~ 109.4%范围内，说明该LFIA对AFB1的定量具有可接受的精度。这一结果表明，我们成功构建了第一个不经预处理直接测定酱油中AFB1含量的方法，有望成为高效液相色谱法(HPLC)的替代方法。

   为了验证所开发的LFIA的可靠性，该技术还用于检测关节液中的金黄色葡萄球菌(关节置换术感染的主要细菌)。以金黄色葡萄球菌分泌的Hla为目标分析物。该试验的检测原理与AFB1类似，其原理是基于固定在T线上的标准抗原对关节液样品中的抗原的竞争性抑制。优化PS@AIE₈₃₀NPs-labeled LFIA测定Hla的免疫测定条件，包括免疫反应时间、T系固定Hla的浓度、PS@AIE₈₃₀NPs@hAb浓度。在最佳条件下，用PS@AIE₈₃₀NPs-immunolabeled试纸检测加入Hla标准的关节液样品(0 ~ 100 ng mL⁻¹)。图中显示，随着HLA浓度的增加，T线荧光带逐渐减弱。Hla浓度和FL强度的相应校准曲线显示，Hla的LOD值为0.02µg mL ^{- 1}，线性范围为0.02 ~ 25µg mL ^{- 1}。通过51例临床关节液样本，包括hla阳性和hla阴性的关节液样本，评价PS@AIE₈₃₀NPs-based LFIA的实用性。所有金黄色葡萄球菌阴性和阳性关节液标本均经临床培养鉴定。PS@AIE₈₃₀NPs-labeled LFIA可以正确区分金黄色葡萄球菌阴性和阳性关节液样品，灵敏度为100%。上述结果表明，所建立的LFIA平台具有良好的可靠性，可用于复杂样品中目标物的测定。

总结

    我们已经成功地设计了一个基于纳米粒子的超亮近红外AIEgens诊断平台，该平台带有便携式读取器，可以准确灵敏地测量复杂样品中的目标浓度。利用PS@AIE₈₃₀NPs的近红外发射和便携式读取器(800 nm长通滤波器)的过滤作用，可以明显消除复杂样品的吸收和自身荧光以及NC膜的光散射干扰，从而解决复杂样品中目标检测精度和灵敏度较差的问题。通过功能化不同的检测抗体，开发的近红外POCT诊断平台对小分子和蛋白质的检测限分别低至10 pg mL ^{- 1}和20 ng mL ^{- 1}，可与相应的金标准法相比较，覆盖了感兴趣的检测范围。由于PS@AIE₈₃₀NPs独立于生物配体，它们可以广泛用于复杂的样品诊断，并且可以用简单的信号读取仪器进行定量分析。这些结果共同表明，所提出的近红外POCT平台可用于准确、灵敏地诊断复杂样品，并可进行大规模测试。

参考文献

Ultrabright NIR AIEgen nanoparticles-enhanced lateral flow immunoassay platform for accurate diagnostics of complex samples ，Jia Shu，Yujian Li，Huan Cai， Qing Fu， Chunyang Li， Jianbo Yuan， Yan Zhao， Changjin Liu， Haiping Wu， Doudou Ling， Zhangluxi Liu， Guannan Su，Qingfeng Cao，Xiaolin Huang， Rui Chen， Peizeng Yang，Aggregate. 2024;e551.https://doi.org/10.1002/agt2.551