内容提要
设计用于选择性靶向神经元的小分子探针的开发将加强对复杂神经元结构和功能的探索。我们介绍了NeuM, NeuO的衍生物，旨在靶向神经元细胞膜。我们阐明了区分神经元的选择性神经元膜运输背后的机制。在含水缓冲液中，NeuM自动组装成胶束结构，导致其荧光猝灭(Φ=0.001)。暴露于神经元后，NeuM胶束通过网格蛋白介导的内吞作用选择性地内化到神经元内体中。通过内吞循环途径，NeuM胶束整合到神经元膜上，将荧光NeuM分子分散在膜上(Φ=0.61)。分子动力学模拟表明，与NeuO相比，NeuM具有最佳的亲脂性和分子长度，有助于其稳定地融入磷脂层。NeuM在神经元膜内的稳定整合使得对神经元的长期监测以及复杂神经元结构的可视化成为可能。
结果与讨论
NeuO衍生物的合成与评价
为了增强NeuO的亲脂性，我们合成了一系列NeuO衍生物，每个衍生物在1,2,3三唑基团的4R位置具有不同长度的烷基侧链。为了评估这些神经元染色能力，我们制备了原代海马神经元并在96孔板中培养。在DIV 7时，用NeuO衍生物处理海马神经元，并在两天内获得荧光图像。根据烷基链的长度，NeuO衍生物表现出不同的神经元染色模式。在所有衍生物中，C7 (NeuM)在2天内表现出最强且持续时间最长的神经元染色模式。NeuM荧光在1.7 ~ 1.9 h内达到平台(95%置信区间)，最大荧光强度水平是2 h时NeuO的3.1 ~ 0.2倍。与NeuM相比，具有更短烷基链的NeuO衍生物表现出更快的神经元摄取和快速淡出。特别是，在处理后，C0几乎立即染色神经元，但荧光很快消失。结果显示，c0处理的神经元在6小时时间点变得无法区分。NeuO或C4的荧光强度在2小时达到最大，随后在11小时的时间点上逐渐下降。具有较长烷基链的NeuO衍生物比NeuM表现出较慢的神经元摄取。达到最大强度，C10需要10小时，C12需要25小时。特别是C14几乎不染色神经元。结果表明，NeuM的庚基链最适合用于神经元标记，具有最强的强度和最长的保留时间。处理48小时后，用每种NeuO衍生物处理的海马神经元进行固定，并用抗β iii -微管蛋白抗体进行染色，以评估神经元的完整性。
神经突生长分析表明，50 nM的NeuO衍生物处理对神经元细胞的完整性没有任何显著影响。此外，MTS实验表明，即使在100 nM浓度和72小时孵育后，NeuM处理也没有引起与线粒体损伤相关的神经元细胞活力的显著变化。这一结果表明，NeuM允许神经元的长期跟踪。为了评估NeuO和NeuM染料对神经元的标记效果，我们用抗β iiitubulin抗体对DIV13成熟的初级海马神经元进行共染色，这些神经元显示出明显的生长和分支。这些神经元最初被标记为NeuO或NeuM。孵育2小时后，使用Operetta CLS高含量成像系统获得荧光图像。这一步至关重要，因为NeuO和NeuM染料是不可固定的;它们的荧光在固定和渗透后显著减弱。随后，固定神经元，用抗β iii -微管蛋白抗体染色，细胞核用Hoechst反染色。随后再次使用Operetta系统进行荧光成像以显示抗β iii型管蛋白和Hoechst染色。利用Harmony 4.9软件进行基于细胞核的全细胞群体分析。在NeuO的病例中，在总共计数的6276 - 43个细胞中，5372 - 215个细胞β iii -微管蛋白阳性，这些β iii -微管蛋白阳性的细胞中有96.1%也是NeuO阳性。1005 ~ 159个βⅲ管蛋白阴性细胞中，15.4%为neuo阳性，提示存在假阳性。另一方面，在NeuM的情况下，在总共6431 237个细胞中，5637 88个细胞β iii -微管蛋白阳性，这些β iii -微管蛋白阳性的神经元中有97.1%也呈NeuM阳性。在744 ~ 113个β iii -微管蛋白阴性细胞中，只有6 ~ 4%为NeuM阳性，假阳性率明显降低。这些结果共同表明，NeuO和NeuM都具有相当高的神经元选择性，但NeuM的假阳性发生率明显较低。将β iii -微管蛋白图像与NeuO或NeuM图像合并进行细胞荧光图分析，测量Pearson相关系数。如前所述，NeuO强烈标记神经元的胞体区域，与β iii -微管蛋白染色的相关系数较低(r=0.48)。NeuM与β iii -微管蛋白染色显示出较高的相关系数(r=0.79)，可见胞体和神经突。
制备含有神经元和星形胶质细胞的皮层神经原代培养物，以评估神经元的选择性。Sulforhodamine 101 (SR101)在活培养中用于星形胶质细胞反染色。DIV7时，原代皮质细胞用20 μM SR101标记2小时。然后，用新鲜培养基洗涤细胞，去除过量的SR101，并用NeuO或NeuM标记。获得荧光图像，并利用细胞荧光图分析SR101与NeuO和NeuM的共定位。SR101与NeuO (r=0.07)或NeuM (r=0.06)的相关系数均较低，证实与sr10染色的星形胶质细胞无相关性。此外，使用NeuM、Tubulin和GFAP进行三重标记。与先前的观察一致，NeuM标记的神经元与β iii -微管蛋白标记的神经元一致，但与抗gfap染色所描绘的星形胶质细胞明显分开。
NeuM染色神经元细胞膜
为了确定NeuM的亚细胞定位，用较低浓度(20 nM)的NeuM处理DIV7的海马原代神经元，并获得高分辨率图像。NeuM染色提供了清晰的体细胞和神经突图像，包括树突和轴突的末端区域。NeuM显示了包括丝状足和板足在内的神经元膜突起，这是β iii -微管蛋白染色未观察到的。此外，NeuM还显示了神经突末端的细胞内囊泡。为了确定NeuM的亚细胞定位，用NeuM标记海马神经元，并制备总组分、胞浆组分和膜组分。在每个组分中，使用紫外灯观察NeuM荧光响应，并使用SpectraMax®(λex=475 nm)测量荧光光谱。在用于制备总细胞裂解物、细胞质部分和膜部分的每个缓冲液中，评估NeuM的基线荧光响应。在整个神经元细胞裂解液中观察到强烈的NeuM荧光响应，表明NeuM在神经元裂解液中保持其荧光状态而不聚集。相比之下，胞质部分没有明显的荧光，而膜部分有明显的荧光响应。这一发现表明，NeuM的荧光形式是选择性地从膜部分恢复，与观察到的神经元成像模式一致。
我们通过合成尺寸小于100 nm的单层囊泡来研究NeuO衍生物的膜整合特性，这些囊泡由70%的二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和30%的胆固醇组成。将每种NeuO衍生物与DOPC/胆固醇脂质体进行处理，并使用SpectraMax®系统在60分钟内观察所得荧光变化。对于每种衍生物，生成荧光强度随时间的曲线图，并与磷酸盐缓冲液和富含洗涤剂的溶解环境的基线条件进行比较。由于NeuO衍生物的荧光在磷酸盐缓冲盐水中仍然受到抑制，因此使用TritonX-100将其溶解，显示其峰值荧光强度。。在测试的衍生物中，NeuM表现出一种独特的模式，其荧光强度在60分钟的持续时间内逐渐增加，最终达到与TritonX-100溶液中观察到的相当的平台。相比之下，当烷基侧链比NeuM侧链短时，荧光增加明显较小，达到平台值的速度也快得多。对于C5，脂质体摄取在5分钟内达到饱和。相反，侧链长于C10的衍生物表现出低效率的脂质体摄取，导致持续的淬灭信号。
不带正电荷的高亲脂性分子倾向于优先积聚在脂膜或脂滴中。然而，亲脂性NeuO衍生物表现出不同的行为。为了研究这种差异，我们利用生物信息学工具对NeuO衍生物的关键分子描述符进行了全面分析，以深入了解它们对膜通透性的影响。这些描述符包括分子量、分子体积、极性表面积、logP和直接预测的细胞通透性。值得注意的是，没有一种NeuO衍生物被预测具有细胞渗透性，因为它们的被动渗透率的对数值一直在狭窄的范围内(5.8至5.9)。在影响被动膜穿透的各种参数中，所有NeuO衍生物的极性表面积(PSA)均较高，为123.32 Å2。通常，PSA大于70 A2的分子应该更亲水，从而使细胞可渗透。因此，预测包括C10和C12在内的所有NeuO衍生物都不会穿透质膜。AlogP值随碳尾伸长率的增大而增大，范围在3.99 ~ 10.41之间。NeuM的AlogP值为7.221。考虑到胆固醇的AlogP值为7.321，我们推测该AlogP值可能是膜定位的最优值。与NeuO相比，在磷脂双分子层模型中，NeuM较长的烷基尾如何影响NeuM的取向，进行了分子动力学模拟。模拟是通过将分子置于POPC双层膜系统中，并在303.15 k的温度下对系统进行100 ns的建模来进行的。在最初的25 ns中，化合物在膜内重新定位，从而在25至100 ns的时间范围内进行定位分析。一般来说，NeuM的2-羟基- nphenylacetamide部分位于脂质磷酸盐头基密集的区域，而BODIPY核心和三唑臂部分则穿过脂质尾部密集的区域。NeuM的烷基侧链延伸到低尾密度的尾部区域，也被称为双分子层的疏水核心，使其更靠近膜的中心。对整个模拟过程的局部分配密度分析表明，NeuM 's BODIPY中硼原子与膜中心的平均距离为0.86-1.08 nm。在NeuO中，硼原子平均距离膜中心更远(1.23 nm)。这种差异归因于NeuM的亲脂性，促进了与脂层疏水核心的疏水接触。此外，NeuM与磷脂双分子层的极性头形成氢键。虽然NeuM和NeuO在2-羟基- n-苯乙酰胺基团和脂质磷酸之间形成氢键相互作用，但NeuM由于其在膜中的倾斜插入，可以在其胺“臂”基团和PC酯羰基氧原子之间形成额外的氢键。总的来说，分子动力学模拟支持NeuM可以很好地定位在磷脂膜内。
NeuM形成胶束，并与神经元细胞膜结合
我们测定了它在不同溶剂中的荧光量子产率(Φ)，如乙醇(Φ=0.54)、1,4-二氧六环(Φ=0.57)和二甲亚砜(DMSO， Φ=0.43)。虽然NeuM在有机溶剂中表现出中等量子产率，但其荧光在水中溶解时完全猝灭(Φ=0.001)。加入TritonX-100 (Φ=0.63)或DOPC:胆固醇(7:3)脂质体(Φ=0.61)后，猝灭的荧光明显恢复。为了研究NeuM在水中的淬火状态，我们进行了透射电子显微镜(TEM)分析。TEM图像揭示了NeuM形成的微细胞结构。此外，动态光散射(DLS)分析表明，NeuM在水中溶解时可以形成纳米级胶束。在浓度为50 nM时，NeuM胶束的平均粒径为49 ~ 18 nM。值得注意的是，在TritonX-100的存在下未观察到NeuM胶束。这一结果表明，NeuM在水性缓冲液中自组装成胶束结构，导致聚集诱导猝灭(ACQ)。通过测量不同含水量的水/乙醇或水/二氧六环二元体系中的荧光光谱来评估ACQ性能。NeuM分子容易溶解于乙醇和二恶烷中，具有较高的荧光量子产率。随着溶剂中水的加入，NeuM的荧光强度逐渐降低，最终在100%水含量时荧光完全猝灭。在乙醇和二氧六环中，诱导ACQ的半有效水含量分别为65.9%和73.5%。同样，NeuM胶束可以通过添加洗涤剂溶解，从而获得高荧光量子产率。此外，NeuM胶束与脂质体融合，将荧光NeuM分子释放到脂质体膜中。已知膜探针MemGlowTM647的作用类似于NeuM。在PBS中，MemGlowTM647组装成胶束，与脂质膜相互作用后，单个分子扩散到脂质双分子层中。为了比较它们的膜选择性，将DIV7的海马原代神经元与NeuM和MemGlowTM647共同处理。NeuM表现出明显的神经元染色，而MemGlowTM647导致包括细胞碎片在内的各种脂质膜染色，如图中白色箭头所示。这一结果表明，与MemGlowTM647不同，NeuM或NeuM胶束可以区分活神经元膜并整合到膜中。
为了研究它们的不同膜选择性，我们制备了三种不同的合成脂质体;(i) DOPC:胆固醇(7:3)，(ii) DOPC:DOPS (3:7)， (iii)天然脑磷脂酰胆碱提取物。对每种脂质体进行NeuM或MemGlow TM647处理，用SpectraMax®测量60分钟内的荧光强度。正如预期的那样，NeuM显示出基于脂质体脂质成分的明显不同的摄取模式。当暴露于DOPS/ DOPC脂质体时，NeuM的荧光增加最慢，最小。DOPS/DOPC脂质体具有暴露磷脂酰丝氨酸(PS)的膜，代表垂死或死亡的细胞膜。[16]NeuM在DOPS/DOPC脂质体膜中的低效整合可能增强其对活神经元的选择性。然而，当暴露于由脑pc提取物组成的脂质体时，NeuM表现出最快速和最显著的荧光增强。相比之下，MemGlow TM647对这三种脂质体表现出统一的整合模式。无论其脂质组成如何，MemGlow TM647的荧光在5分钟内急剧快速增加，达到饱和。这一结果表明，NeuM可能对活神经元中发现的特定类型的膜或膜成分表现出偏好。然而，当NeuM作为人工脂质体的一部分递送时，神经元选择性消。作为我们对染料非特异性疏水相互作用特征研究的延伸，我们检测了它们在牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)存在下的荧光反应同样，MemGlowTM647对HSA和BSA均表现出剂量依赖性的荧光反应，表明非特异性相互作用。相比之下，NeuM在暴露于HSA或BSA时均未表现出明显的荧光强度变化。接下来，我们评估了NeuM从各种培养细胞系中分化原代神经元的能力，包括星形胶质细胞(C8-D1A)，小胶质细胞(SIM-A9)、神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和宫颈癌细胞(HeLa)。每个细胞用四种不同浓度(25、50、100和250 nM)的NeuM孵育2小时，并用Hoechst对细胞核进行反染色。使用Operetta®软件获取荧光图像，使用Harmony 4.9软件对荧光强度进行量化。在所有浓度下，与其他细胞类型相比，NeuM在原代神经元中表现出最显著的荧光反应。在100 nM以下，NeuM染色仅用于原代神经元。在其他细胞系中，荧光强度不到原代神经元的9%;具体而言，在100 nM处，相对强度如下:C8-D1A;5.2±1.2%,SIM-A9;3.5±0.5%,SH-SH5Y;8.6 - 1.4%， HeLa;7.3±0.1%。在250 nM处，NeuM继续表现出对原代神经元的选择性，尽管它的荧光也可以在其他细胞类型中检测到。值得注意的是，在测试的细胞系中，源自神经母细胞瘤的人类细胞系SH-SY5Y细胞显示出显著的荧光增强，与原代神经元相比，荧光强度为36.5 - 4.2%。而其他细胞的信号强度保持在15%范围内:C8-D1A;13.4±0.1%，sim-a9;9.3 - 0.3%， HeLa;14.9 ~ 0.9%。结果表明，NeuM对原代神经元具有较好的选择性。考虑到NeuM染色在活神经元而非死神经元中有效，活神经元特异性的活跃细胞过程将包含NeuM的选择性摄取。
网格蛋白介导的内吞作用是NeuM转运的进入途径
为了确定NeuM的神经元摄取机制，小分子抑制剂调节胞内分泌途径;丹参草碱，三氟拉嗪，染料木素，内啡肽2，或exo1.在NeuM暴露前，用每种抑制剂处理DIV6的原代神经元。随后，使用Operetta®获取两小时内的NeuM荧光图像，并使用Harmony 4.9软件分析荧光强度以评估神经元摄取。在基础条件下，神经元荧光强度在最初30分钟内急剧增加，其特征为SlopeBasal=0.43±0.03 (R2=0.99)。在测试的抑制剂中，网格蛋白介导的内吞作用抑制剂，丹嘧啶cadaverine和三氟拉嗪对NeuM摄取的影响最为显著，表明slopedansylcadaverine =0.13 ~ 0.01 (R2=0.98)， SlopeTrifluoperazine=0.14 ~ 0.02 (R2=1.00)。值得注意的是，高分辨率图像显示，用丹西尸碱预处理后，体细胞和神经突末端的NeuM摄取明显减少。此外，胞吐和内体膜再循环抑制剂endosidin2也显著减少NeuM的摄取，SlopeEndosidin2= 0.19±0.01 (R2=0.99)证明了这一点。相比之下，NeuM摄取仅受到染料木黄酮(一种小囊泡介导的内吞作用抑制剂)和高尔基内质网运输抑制剂exo1的影响，SlopeGenistein=0.42±0.02 (R2=1.00)， SlopeExo1=0.39±0.02 (R2= 0.99)。这一结果表明，网格蛋白介导的内吞作用(CME)和胞吐作用途径对初级神经元摄取NeuM至关重要。值得注意的是，这些抑制作用在高分辨率图像中表现出明显的模式。当丹西尸碱抑制网格蛋白介导的内吞作用时，NeuM荧光在整个神经元区域均匀下降，表明CME是NeuM胶束的主要进入途径。相反，当内sidin2抑制内体循环时，在内体囊泡中观察到微弱但集中的NeuM荧光信号。这一结果表明，胞吐抑制可阻止NeuM进入质膜，使其被限制在内体囊泡内。因此，网格蛋白介导的胞吞作用和胞吐作用在促进初级神经元中NeuM的运输中起着关键作用。
尽管如此，网格蛋白介导的内吞作用是一种普遍存在的机制，负责真核细胞中各种大分子、蛋白质和脂质的分选和内化。为了探索原代神经元中CME的潜在独特特征，我们在DIV6时制备了C8D1A、SIM-A9、SH-SY5Y、HeLa和原代神经元的细胞裂解物，并评估了与网格蛋白依赖性和独立内噬作用(CIE)和核内体相关的蛋白质水平。有趣的是，与所有其他细胞类型相比，原代神经元表现出明显更高水平的cme相关蛋白，包括网格蛋白、AP2、转铁蛋白和动力蛋白。特别是在原代神经元中观察到大量转铁蛋白和动力蛋白的表达。与原代神经元相比，其他细胞类型的转铁蛋白水平显著降低:C8-D1A为4.1%，SIM-A9为14.4%，SH-SY5Y为33.2%，HeLa为22.8%。其他细胞类型的dynamin水平也显著降低，C8-D1A为14.4%，SIM-A9为12.8%，SH-SY5Y为25.3%，HeLa为10.5%。值得注意的是，SH-SY5Y细胞的转铁蛋白和动力蛋白表达量第二高，这与图所示的NeuM摄取模式一致。这一结果表明，cme相关蛋白的表达升高可能是神经元参与NeuM神经元选择性运输的一个关键特征。另一方面，caveolin-1和caveolin-2在DIV6的原代神经元中表达最少。相比之下，C8-D1A星形胶质细胞显著表达caveolin-1和caveolin-2，分别比原代神经元增加10.0 ~ 0.4和9.8 ~ 1.8倍。考虑到NeuM对C8-D1A星形细胞无效，小泡介导的内吞作用可能不是NeuM的进入途径。此外，早期核内体抗原(EEA)和Rab7等核内体蛋白在原代神经元内的表达没有显著性差异。
为了研究网格蛋白介导的内吞作用下NeuM的神经元运输，我们用mccherry -网格蛋白构建物转染了初级海马神经元。DIV6时，将mCherry-clathrin注入神经元，24h后用NeuM (50 nM)标记神经元。使用Operetta CLS每10秒捕获NeuM和mCherry-clathrin的荧光图像，持续20分钟。在910秒的时间内，生成延时图像的表情图，以显示用NeuM或mcherry -网格蛋白标记的轴突囊泡。根据表情图，我们可以划分出四种不同类型的囊泡。固定囊泡被NeuM和mcherry -网格蛋白强烈标记，并保持不动超过910秒。运动的囊泡被NeuM和mcherry -网格蛋白标记，并沿轴突表现出明显的运动。整合囊泡最初对NeuM和mcherry -网格蛋白表现出微弱的信号，但随着时间的推移，这些信号增强，表明NeuM被积极纳入新的依赖网格蛋白的内吞囊泡的形成。在释放囊泡的情况下，它们表现出NeuM标记，但与mccherry -网格蛋白无关，表明这些囊泡不是网格蛋白包被的内吞囊泡。此外，在这些释放囊泡中，NeuM的荧光随着时间的推移逐渐减弱，这表明NeuM要么从囊泡中释放出来，要么与质膜融合。基于血气图的细胞荧光图分析显示NeuM和mCherry-clathrin之间存在相对较高的相关性(r=0.81)。这些结果提供了明确的证据，表明NeuM被积极地结合到网格蛋白包被的囊泡中，并且NeuM阳性囊泡具有沿轴突移动或与神经元膜融合的能力。
总结
网格蛋白介导的内吞作用(CME)是囊泡运输的一个关键过程，负责将各种货物分子从细胞表面运输到内部。特别是在神经元中，CME在神经递质释放后突触囊泡的再循环，以及在响应配体结合或细胞内信号级联激活的突触后膜受体调节中发挥关键作用。本研究表明，即使在神经细胞分化的早期阶段，cmera相关蛋白也在原代神经元中高度表达。这种升高的cme介导的运输促进了NeuM胶束进入神经元细胞的有效内在化。因此，NeuM分子融入神经元细胞膜，可见整个神经元结构，包括神经突。由于这种膜运输机制，NeuM对活神经元表现出优越的选择性，而不是标记死亡的神经元或细胞碎片。原代神经元和神经细胞培养被广泛用于研究神经元的结构和功能。特别是，包括神经元、星形胶质细胞或小胶质细胞在内的混合神经培养对于理解神经元炎症和变性的关键因素以及机制至关重要。我们预计，在这种复杂的原代培养系统中，NeuM可以证明在跟踪神经元和指示神经元完整性方面有价值。我们相信，在这种复杂的原代培养系统中，NeuM将有助于跟踪神经元并报告神经元的完整性。
参考文献
NeuM: A Neuron-Selective Probe Incorporates into Live Neuronal Membranes via Enhanced Clathrin-Mediated Endocytosis in Primary Neurons， Yoonsik Sung , Lizaveta Gotina, Kyu Hyeon Kim , Jung Yeol Lee, Seulgi Shin, Hira Aziz, Dong Min Kang, Xiao Liu, Na-Kyeong Hong, Hong-Guen Lee, Jun-Seok Lee, Hyeyeong Ku, Cherlhyun Jeong, Ae Nim Pae, Sungsu Lim,* Young-Tae Chang,* and Yun Kyung Kim*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202312942，doi.org/10.1002/anie.202312942
内容提要
急性肾损伤(AKI)是一种普遍而复杂的临床疾病，与发病率和死亡率升高有关，需要在全球范围内对肾损害进行细致的检测和监测。由于分子探针和检测器的敏感性、快速性和成本效益，生物医学对AKI的分子探针和检测器表现出浓厚的兴趣。生物成像技术在识别和量化AKI指标，增强诊断方法以及潜在地改进临床治疗以立即控制损伤方面发挥着重要作用。分子探针是药物筛选、发现肾保护成分、信号通路和药物肾毒性作用的重要工具。本文综述了分子探针的最新进展，强调了它们在肾脏清洁性、多通道检测能力、近红外ⅱ响应性和对活性氧的反应性等方面的卓越功效。这些探针为评估肾脏损害和评估药物的治疗效果提供了增强的好处，同时减少了毒性作用。此外，本文还探讨了该领域未来的潜力和挑战，旨在促进分子生物成像技术在肾脏疾病早期诊断和治疗中的发展和提高。
AKI的生物成像策略
现代医学严重依赖生物分子数据来诊断和监测疾病状态。这些数据不仅用于诊断目的，而且在评估药物和其他治疗干预措施的有效性方面也起着至关重要的作用传统上，使用昂贵的设备、复杂的设施和劳动密集型的方法，使用传统的临床方法(如质谱法、色谱法和酶联免疫吸附法)从体液中提取这些信息即使存在缺陷，有几种临床方法仍被认为是黄金标准，因为它们产生的结果非常精确和一致因此，迫切需要探索新的方法，为监测医学标本(如用于诊断的体液)中的生物分子、药物和副产品提供敏感、一致和具有成本效益的分析措施，并用于跟踪治疗干预措施建立用于检测AKI和筛选药物治疗效果的生物成像平台是当今推进临床实践的最流行策略之一。为此，各种生物成像技术，包括等离子体和电化学探测器，纳米颗粒的结合和各种生物识别成分(如抗体，适配体，分子印迹分子)被应用于提高探测器的诊断能力。
分子成像
分子成像，一种非侵入性的方法，证明了实时监测生物体疾病进展的能力。它有望对肾脏中的细胞事件进行纵向体内跟踪，为具有挑战性的基于静态分析的体外诊断技术提供了有价值的替代方案。而单光子发射计算机断层扫描，对比度增强计算机断层扫描，磁共振成像，和超声检查通常用于肾脏筛查，它们主要用于检测器官的解剖和功能变化，而不是特别有助于识别发生在早期阶段并导致aki的分子变化。光学成像用于跟踪动物模型中的疾病演变并反复探测分子事件化学发光成像和荧光/磷光成像是利用不同的化学或生物过程来实现精确测量的两种成像方法荧光成像在过去十年中取得了显著的进步。由于其高灵敏度、准确性、非侵入性、优异的时空分辨率和实时监测能力，它正在成为化学、生物学和医学领域越来越有用的研究方法。由于其紧凑的尺寸和灵活的可修改性，小分子荧光探针往往是非常重要的荧光成像方法。
许多生物活性分子的荧光探针的可用性，包括金属离子、硫醇、蛋白质/酶、pH、活性氧(ROS)、活性氮(RNS)和活性硫(RSS)，大大提高了我们对这些物种生物学的理解这是一种检测不同生物分子的非侵入性方法与传统方法相比，使用荧光探针可以实时连续监测活细胞中生物反应的表达水平和催化活性。这显示了巨大的应用潜力另一方面，化学发光的特点是通过称为化学激发的化学反应产生光，已经发展成为一种先进的体内生物成像和治疗方法。它可以成功地消除荧光技术中存在的背景自身荧光，因为它不需要外部光学刺激，为生物成像提供了非常准确的检测和信噪比本综述分为五个不同类别的分子探针，旨在引导读者了解这些不同类别荧光探针的最新进展。每个类别在检测和理解AKI方面都有特定的目的。如方案1所示，第一类涉及基于肾脏清除率的探针，它利用肾脏的自然过程进行检测，并利用荧光成像提供对AKI的实时洞察。
第二类侧重于多色荧光探针，提高生物成像精度。第三类探索近红外(NIR) II荧光探针，与早期的NIR- i窗口相比，它提供了卓越的成像质量，更高的信噪比和更深的组织穿透。第四类介绍ros响应探针，用于检测氧化应激，识别AKI的早期阶段并可能影响其进展。最后，第五类是用于高通量药物筛选、揭示肾保护成分、阐明信号通路和研究药物肾毒性作用的分子探针，代表了分子成像的前沿研究领域。
基于肾间隙的AKI成像探针
许多造影剂不适合临床翻译是由于体内成像时器官滞留引起的急性或慢性毒性。为了减轻器官滞留引起的毒性，了解这些药物的药代动力学特征并优化其体内清除途径至关重要基于肾脏清除率的荧光探针利用肾脏的自然过滤和排泄过程来检测和监测急性肾损伤(AKI)这些探针经常使用荧光成像技术来提供有关探针从体内肾脏清除的实时数据。Huang等人报道了一种先进的可肾清除激活双报告基因(ADR)的合成，用于造影剂诱导的急性肾损伤(CIAKI)的实时体内成像。ADR具有化学发光和近红外荧光(NIRF)信号通道，可被溶酶体损伤(NAG)和氧化应激(超氧阴离子，O2•−)特异性激活。。在活体小鼠肾脏中检测到O2•−和NAG水平的逐渐增加，在CIAKI后肾小球滤过率(GFR)和组织损伤显著下降之前，由于其特殊的肾脏清除率(24小时注射后给药剂量的80%)。ADR优于标准临床试验，可提前16小时(化学发光)和至少8小时(NIRF)显示CIAKI。同样，Huang等人引入了用于精确跟踪尿液消除的分子肾探针(MRPs)。这些探针使药物性AKI的原位光学成像成为可能。通过利用早期AKI指标，如O2•−、NAG和caspase-3来激活NIRF或化学发光信号，研究小组实现了活体小鼠肾脏分子事件的纵向成像。他们在临床表现明显的AKI之前观察到细胞凋亡、溶酶体降解和氧化应激。与以前的方法相比，MRPs可以至少提前36小时对顺铂诱导的AKI进行无创检测，超越了传统的尿液分析技术，为早期AKI诊断提供了有希望的临床应用。
为了实时成像肾脏中的ROS和RNS, Huang等人合成了两种具有高肾清除率的近红外化学发光报告细胞(ncr)。ncr的化学发光成分和肾清除增强剂分别是Schaap 's含二氧乙烷的改性双氰亚甲基- 4h -吡喃和β-环糊精单元。NCR1和NCR2分别对O2•−和过氧亚硝酸盐(ONOO−)有选择性地激活近红外化学发光。由于其高肾清除率和纳摩尔敏感性，ncr允许在肾毒性暴露期间对肾脏中的活性氧和氮(RONS)进行无创监测，并检测细胞中内源性RONS的细微过表达。当药物引起AKI时，与NCR2相比，NCR1的激活速度更快，这意味着O2•−和ONOO−的有序升高。
此外，排出的ncr的荧光可以用于AKI的尿液分析，有助于在组织学调查前至少24小时识别出RONS过表达。因此，本工作提出了超灵敏的近红外化学发光探针，并为将其转化为有效的体内器官检测显像剂提供了指导。
Zhang等人创建并合成了一种小分子PA探针(BDP-3)。他们发现，在生理环境下，BDP-3可以形成完全可清除的纳米聚集体。当BDP-3中H2O的百分比从40%增加到90%时，其水动力直径从0.64±0.11 nm增加到3.74±0.39 nm。此外，这种意想不到的变化与PA强度显著增加2.06倍有关。
因此，在PA成像中使用BDP-3为安全检测化疗、中药和药物对比治疗诱导的动物模型AKI提供了一种新的方法。与标准血浆指数测试相比，该方法显示出更高的准确性，表明在未来的临床诊断中具有重要的潜力Zhou等人开发了两性离子单分子半青氨酸(ZCs)作为药物性肾衰竭(DIRF)早期检测的可激活报告基因。他们通过整合烷基磺酸盐和季铵盐阳离子获得两性离子特性，从而实现最小的血浆蛋白结合(<5%)和高肾脏清除率(约96%)。它们的可激活报告基因ZCRR隐藏在caspase-8可切割的四肽中，在顺铂诱导的DIRF小鼠肾脏中有效积累，在caspase-8激活时发出近红外荧光信号。这使得肾内细胞凋亡的敏感检测比临床方法早60小时，从而可以精确评估细胞凋亡修复效果。这也为远程DIRF检测和通过光学尿液分析预测肾脏保护效果提供了潜力。
多色荧光探针在AKI进展中的应用
理论上，使用两个探针同时视觉跟踪不同的分析物或生物标记物是可能的。然而，增加两个探针可能会出现频谱重叠、反应交叉和其他问题等挑战。因此，使用多通道或多色探针对于实现精确的生物成像是有利的它是指用于化学和生物学研究的一类分子仪器，目的是观察和分析细胞或组织的不同部分。这些探测器发射的各种波长的光使研究人员能够同时监测和区分样品中的多个目标和结构。这种多功能性提供了诸如提高诊断准确性、提高诊断效率、降低诊断成本和减少患者不适等好处。
Tong等人用Brite 670和Dabcyl-KFFFDEVDK-FAM包裹在低分子量壳聚糖纳米颗粒中，描述了一种肾细胞靶向双信号纳米探针(图3A)。他们的共聚焦荧光成像结果显示，纳米探针可以在药物性肾损伤(DIKI)的晚期看到caspase-3的激活，在肾细胞和组织水平的早期阶段看到羟基自由基(•OH)的上调。
他们声称，采用纳米探针成像技术，小鼠DIKI模型中8小时的阳性时间优于血尿素氮或Scr的72小时，Cys C的16小时和KIM-1的24小时。他们的发现表明，纳米探针将成为鉴别成像和有效早期预测DIKI的有用工具。
Liu等人创建并合成了BODIPY-P，这是一种双通道、快速响应的水溶性荧光探针，专门用于检测次氯酸(HOCl)。在去离子水(PBS缓冲液，pH 7.4)中加入次氯酸钠(NaClO)后，探针表现出比例荧光变化，表现出肉眼可见的快速反应。荧光颜色由红色变为橙色。荧光强度比F567/F629稳定增加，与HOCl浓度在0 ~ 5等范围内呈较强的线性关系，估计检出限为31.6 nM，可定量检测微量HOCl。荧光滴定测试表明，该探针对其他活性氧(ROS)、生物硫醇、常见阴离子和生理上重要的阳离子具有很强的选择性和竞争能力。该探针最显著的特点是其低毒性和穿透细胞膜的能力，能够快速监测内源性和外源性HOCl。
此外，Liu等人引入了一种HOCl激活探针(FDOCl-22)，用于药物性AKI的双模早期识别。在本研究中，该探针对HOCl有很高的敏感性，且可溶于水。FDOCl-22与HOCl反应后，近红外发射和吸收显著增加;因此，药物性AKI与HOCl水平有关。此外,它是确定使用NIRF和PA成像使药物引起的肾衰竭的初始阶段筛选成为可能通过收集数据从体内成像的阿基老鼠肾脏的荧光图像的一系列小鼠腹腔注射顺铂不同浓度(0、10、20和40毫克/公斤)的不同时期(12、24、48和72 h),然后通过静脉注射FDOCl-22(200μL×0.5毫米)(左),各组平均荧光强度输出(右)，生物传感器检测结果与现有检测试剂盒比较，顺铂诱导AKI小鼠体内PA成像。通过利用受体介导的结合和保留效应以及酶触发的荧光激活，Weng等人开发了一种多通道可激活的NIRF探针(1-DPA2)，用于原位检测AKI 。他们的方法侧重于磷酸化丝氨酸(PS)和半胱天冬酶3 (Casp-3)。由于其双重靶向重要的凋亡生物标志物，外化PS和活性Casp-3，它显示出增加的近红外荧光和显著的信号背景比(SBR)。这种能力使得在治疗后24小时更容易识别顺铂诱导的AKI动物。研究人员利用1-DPA2实时荧光成像成功显示了NAC治疗后AKI小鼠肾功能的逐渐恢复。此外，该探针能够跟踪小鼠AKI发病时肾脏中Casp-3的逐渐激活。本研究表明，1-DPA2可以同时靶向PS外化和Casp-3激活，长期监测肾细胞凋亡。他们表示，这可能有助于抗AKI药物的原位有效筛查，AKI的早期发现，以及预防可能的肾毒性药物。
Pu等人提出了一种独特的多模双光子聚集诱导发射荧光探针(tp - ld)，用于高灵敏度检测脂滴(ld)的极性变化。尽管其数量很少，但探针对ld具有很强的选择性和优异的光稳定性。此外，利用荧光强度、寿命和波长来区分正常细胞和肺肿瘤细胞，有可能识别AKI细胞模型中的LD极性变化。此外，他们首次揭示了AKI小鼠模型中ld极性的改变及其管理。此外，他们证明在A549荷瘤小鼠模型中，tp - ld可以区分肿瘤和健康组织，以及人的恶性和正常肺组织。因此，该探针为医疗环境中的肺肿瘤诊断提供了新的见解，并作为评估细胞和动物中AKI和肿瘤的有力工具此外，病理生理条件，如内皮功能障碍，可以破坏谷胱甘肽(GSH)，它在维持正常的细胞内稳态中起着至关重要的作用。
内皮功能障碍的标志是ROS和RNS过量，其中包括O2•−，导致一氧化氮(NO)的生物利用度降低。GSH的破坏以及ROS和RNS的存在作为AKI等疾病的指标，有助于识别细胞损伤它可以与生物硫醇进行快速可逆的Michael加成反应，并且可以在细胞和组织中使用Zhao等人创建的可逆NIRF探针flavo - n进行实时跟踪。在不到5秒的时间内，该探针与GSH (k = 1286 M−1 s−1,t1/2 = 729 ms)发生快速可逆反应。值得注意的是，在505 nm和728 nm处，flavo - n发射强度比的变化提供了GSH浓度变化的实时反馈。他们发现当黄素- n存在时，成像细胞内谷胱甘肽的变化是快速和可逆的。重要的是，flavo - n的近红外发射和快速响应时间使其成为跟踪活小鼠GSH变化的有效工具。这种可逆的近红外近红外探针可以更深入地了解内源性GSH的功能。
近红外荧光探针用于AKI成像
由于荧光成像具有很高的灵敏度、很强的特异性和出色的时空分辨率，它在许多重大疾病的诊断和治疗中都是有用的。然而，经典的NIR-I (700 ~ 900 nm)荧光成像的实际适用性受到许多问题的限制，包括低组织穿透性。由于减少了光子散射和组织自身荧光，近年来，NIR-II (1000 - 1700 nm)荧光成像显示出比在NIR-I窗口中观察到的更好的成像质量、更高的信噪比和更深的组织穿透。
Tan等人创建了一种NAG激活的NIR-II荧光纳米探针(BOD-IINAG-NP)，用于糖尿病诱导的CKD的原位成像和跟踪药物诱导的AKI的发展。作为肾脏疾病的生物标志物，NAG可以特异性激活纳米探针产生NIR-II荧光信号，从而在活体小鼠体内观察肾功能衰竭。值得注意的是，nanoprobe的主动成像机制使其能够比目前大多数可用的测试至少提前32小时有效检测药物性AKI的发病。这表明，他们合成的纳米探针可能有一天被用作早期检测AKI的光学显像剂。此外，纳米探针产生的NIR II荧光可以广泛穿透糖尿病肾病小鼠相对较厚的脂肪层，从而实现高分辨率的体内成像，并表明其用于精确诊断CKD的临床前景。
Chen等人使用肽介导注射来证明NIR-II荧光团在肾脏内长时间积累(>48小时)。有证据表明，肾脏快速清除的超小纳米颗粒和肝脏清除的有机分子在与高极性肽结合后都能在肾脏中维持。此外，研究人员还开发了一种肾脏靶向肽ros反应激活双侧NIR-II探针，可用于体外尿液分析和体内长期肾脏监测。基于肽的检测器能够在早期识别肾脏损害并提供肾衰竭发展的最新信息，这对于优化化疗方案和在给药期间及时采取肾保护措施尤其重要此外，Zhang等人还提出了双激活荧光探针PN910，该探针在pH高于7.4时对H2O2和ONOO−具有很强的选择性。PN910位于NIR-II窗口。
因此，他们证明PN910可以用于准确和特异性地实时监测活体动物的膀胱炎和结肠炎。这项研究提出了一种用于体内生物成像的双激活探针的新方法为了生产可被肾脏清除和激活的发光金纳米颗粒(AuNPs)，这种纳米颗粒不依赖于生物标志物，用于早期肾损伤的敏感和长期成像，Zhao等人设计了一种简单的体内配体交换策略。三苯基膦-3,3 '，3″三磺酸(TPPTS)包被的AuNPs (~ 1.4 nm, TPPTSAuNPs)与可测量量的GSH的配体交换导致在第二近红外区域(~ 1026 nm)显著的主动发射。研究有效地证明，细胞中，特别是肝窦中，高水平的GSH可以在非常低的背景下触发TPPTS-AuNPs的发射，从而实现肝脏和肾脏的体内可视化和细胞成像。此外，GSH交换的TPPTSAuNPs在体内表现出与酸性肾小管上皮细胞更好的相互作用，导致长期(>6.5 h)和敏感(对比指数，~ 3.9)无创监测酸中毒诱导的早期肾损伤。这种简单的配体交换技术为发光探针的开发创造了新的机会，发光探针可以在不需要生物标志物的情况下被激活，从而实现疾病的早期检测和治疗欧阳等人开发了一种生物标志物激活探针，使用NIR-II荧光成像来识别急性肺或肾损伤。他们提出了一种设计方法，包括在中心环己基核上添加叔丁基和吡啶基团，以改善水溶性，增强空间拥挤，并创造一个可以添加分析响应成分的空间。所制得的NP-N染料超过了吲哚菁绿(ICG)等基准七甲基菁，并发出NIR-II光。利用HPN1，他们产生了HP-H2O2，并展示了加入H2O2如何增强NIR-II的荧光强度。然后，在小鼠急性肺和肾损伤模型中评估HP-H2O2。
糖尿病最显著和最广泛的影响之一是糖尿病肾病(DN)，目前还没有足够的预防和治疗策略。其中一种DN生物标志物，亮氨酸氨基肽酶(LAP)，与小管或肾小球损伤有关。因此，虽然目前缺乏这样的策略，但在DN疾病模型中原位测量LAP功能具有早期发现和预防的优势。Yin Liu开发并构建了具有近红外荧光信号的酶激活探针HD-LAP，旨在鉴定LAP在DN模型中的活性。HD-LAP与LAP反应后，由于分子内电荷转移过程，HD-LAP荧光明显增强，并发出近红外光。此外，HD-LAP可以可视化HepG2和HK-2细胞中LAP的活性。值得注意的是，HD-LAP是首次在DN小鼠临床血清样本中实现实时LAP成像。这些发现表明，HD-LAP在未来作为研究lap相关糖尿病疾病的工具具有很大的潜力。
ROS反应探针追踪AKI损伤进展
多种因素诱导的氧化应激是早期AKI发病的主要原因虽然人体需要微量的活性氧才能达到最佳功能，但高浓度的活性氧是有害的，会导致器官损伤O2•−被认为是最有害的ROS类型，因为它可以与其他分子相互作用形成继发性ROS。在缺血再灌注损伤(IRI)早期，NO和O2•−都存在失调。NO能够扩散到线粒体中并与O2•−发生反应，导致过氧亚硝酸盐的局部生成。高度反应性和破坏性的活性氧物种ONOO -在氧化应激下形成，并直接或间接地与脂质、DNA和蛋白质发生反应，导致细胞损伤、炎症和死亡，最终导致AKI。因此，在肾脏中识别ONOO -对于AKI的及时诊断至关重要。然而，由于ONOO−在生理环境中的寿命非常短(~ 10 ms)，传统的生物学实验无法分离组织并检测该物种。已经专门制造了几种探针来成像活细胞中的ONOO -。
Lv等人开发了两种新的线粒体靶向荧光探针，用于定位O2•−转移的开始，并以高精度和选择性分析AKI。利用双模型共聚焦成像，高选择性和精确的小分子荧光探针(Naph-O2•−和NIRO2•−)有效地检测活细胞和组织内内源性产生的O2•−。这种方法能够监测药物性肾损伤期间O2•−浓度的变化。值得注意的是，NIR-O2•−探针的首次应用揭示了左旋肉碱(LC)对药物肾毒性的保护作用。
因此，这些探针可以作为研究O2•−在复杂肾毒性系统中的作用的有价值的工具基于硅罗丹明B螺二硫内酯，Wang等开发了一种高选择性的近红外荧光探针(LysoSiR2S)用于检测HOCl。该探针首次成功用于检测各种活细胞中产生的HOCl，并观察庆大霉素诱导急性肾损伤后体内内源性HOCl的变化同年，Huang等人又发明了Cy-HOCl近红外荧光探针，对细胞内和体内的HOCl进行选择性成像。Cy-HOCl含有两个部分:作为荧光调制器的近红外七甲基菁荧光团和作为响应单元的4-氨基-3-硝基苯酚基团。Cy-HOCl检测HOCl具有良好的灵敏度和选择性。本文综述了Cy-HOCl在细胞中的缺氧反应行为，以阐明缺氧与HOCl之间的联系。此外，该方法还被用于定量小鼠急性缺血模型组织中HOCl的体外含量，并监测缺氧斑马鱼模型中HOCl的实时变化Liu等人开发了一种基于fret的探针来绘制顺铂引起的急性肾损伤中ONOO−的变化。当ONOO−加入后，它显示出比例近红外荧光，在719 nm处吸光度峰值急剧下降，这分别导致光声成像和荧光信号的显著改变。
Wang等发现了一种内征肾靶向近红外荧光团，基于该荧光团，Wang等开发了一种针对ONOO−的荧光探针(KNP-1)， ONOO−在AKI早期升高。经静脉注射后，KNP-1在肾脏中表现出优先分布，只有在ONOO−激活后才表现出荧光。这些特征产生了非常好的肾脏对比成像结果。在活小鼠中，KNP-1识别出缺血再灌注损伤和肾毒素诱导的AKI。用KNP-1处理的小鼠模拟AKI疾病的时间分辨成像显示，随着疾病的进展，肾脏ONOO -水平逐渐升高。值得注意的是，与临床流行的SCr和BUN技术相比，ONOO -的升高至少在24小时前出现。它也可以很好地阻止ONOO -生成。研究结果表明，KNP-1作为一种靶向ONOO−的AKI早期诊断和治疗工具的潜力，突出了该方法的临床意义。此外，它说明了利用天然存在的组织靶向开发具有最佳成像对比度的探针的价值。
对于炎症的实时体内成像，Tao等研制了BOH-HCy-Man荧光探针。他们还创建了一种缺乏巨噬细胞靶向成分的参考探针BOH-HCy。与参考探针(10.2倍)相比，该探针在体外表现出更高的准确度(19.1倍)，这归因于其对H2O2的更高速率常数。BOH-HCy-Man由于其巨噬细胞靶向能力，在原位表现出1.3倍的荧光增强，在炎性巨噬细胞系中表现出1.6倍的荧光增强。他们期望他们合成的探针能够快速、及时地有效检测炎症相关疾病Yang等人也首次使用近红外(NIR)荧光探针(NFP-ONOO)来评估在死铁介导的AKI中ONOO−的变化。探针NFP-ONOO在鉴定ONOO−时表现出良好的特异性和敏感性。此外，他们证明白藜芦醇(Res)抑制铁下垂，从而减轻叶酸(FA)引起的AKI和顺铂(CP)。从整体上看，这些研究为铁中毒介导的AKI的预防、鉴定和治疗提供了强有力的建议。
分子探针用于AKI药物筛选
近年来，利用黄酮类化合物、72皂苷、73多酚等天然产物治疗IRI的研究深度显著增加。天然产物的开发过程中存在着许多困难和挑战。天然产物的筛选、提取、分离和结构鉴定往往基于经验判断，导致资源和时间的浪费鉴于光学成像探针是药物筛选最有效的方法之一，76,77，预计即将开发的分子成像探针也将作为寻找肾保护成分的筛选工具。ER-(4′-三氟甲烷磺酰氧基-2,2′:6′，2′-三吡啶-6,6′-二基)二(亚硝基)四(乙酸)(NFTTA)- eu3 +/Tb3+是Tang等人报道的一种基于镧系配合物的O2•−ertargeting发光探针。该探针用于跟踪活细胞和实验动物中O2•−的产生，以高灵敏度监测药物诱导的AKI。该探针与比例时间门控发光(RTGL)成像方法结合使用，可以准确跟踪各种刺激引起的活细胞内质网中O2•−水平的变化。更显著的是，庆大霉素和顺铂引起的肾损伤小鼠的O2•−浓度水平显著升高。此外，首次证实并阐明了EGCG和LC对庆大霉素和顺铂所致肾毒性的保护作用。结果表明，合成探针在诊断和治疗肾毒性疾病以及观察和跟踪DIKI.78中的O2•−方面具有潜力。
Liu等人开发了一种使用发色团修饰金纳米团簇的比例荧光技术，用于快速直接筛选药物引起的急性肾损伤。这些金纳米团簇对活性氧的检测限为14 nM，表明它们对活性氧具有很高的灵敏度。在穿过肾小球滤过屏障后，基于金纳米簇的探针可以测量肾脏中ROS水平的变化，并评估药物引起肾毒性的可能性。他们还使用肾毒性雷公藤甲素作为模型药物，并使用纳米探针来展示如何筛选药物引起的早期肾损伤，这是传统诊断方法无法做到的。他们人工生产的荧光探针还可以鉴定草药中额外的肾毒性成分，如马兜铃碱，为检测草药补充剂引起的肾毒性提供了一种高通量方法。
为了提供AKI中•OH的敏感和聚焦成像，Gao等人设计并合成了一种可激活的荧光/PA探针(CDIA)。由于其快速的激活动力学和近红外荧光/PA通道，CDIA可以确定•OH在AKI模型中何时开始发展。与传统的临床测试(如Scr和BUN检测)需要48小时的检测时间相比，该探针在12小时内实现了检测。此外，该团队声称，使用CDIA创建了一种高通量筛选草药天然•OH抑制剂的方法。他们检查了其作为筛选抗氧化剂方法的潜力，该方法可能会减少•OH的发展。此外，肾脏近红外荧光信号和PA强度逐渐增加表明，随着时间的推移，肾脏损伤从轻度到重度进展。同样，小鼠肾脏的双模式图像显示顺铂治疗后PA振幅增加，但如果动物事先接受葛根素治疗，则效果下降。此外，该组激活Sirt1/Nrf2/Keap1信号通路，筛选葛根素，保护AKI中的肾细胞。
因此，该团队提出，双成像探针CDIA将是鉴别患者临床AKI和其他ros相关疾病的可行选择，从而揭示ros相关的病理过程，整体提高诊断效能Zhang等人研究了AKI中涉及的初级氧化还原对，并开发了一种定制的PA成像探针(ABDiOH)，对ClO−/GSH具有高特异性和敏感性。利用无创PA成像，该探针可以实时监测AKI，检测灵敏度高于血液检查。该探针也被用于筛选肾脏保护药物的天然项目。黄芪甲苷首次被发现是治疗AKI的潜在有效的新型药物。口服黄芪甲苷可有效减轻肾脏损害，而不会对其他健康组织造成伤害，并且易于被动物身体吸收。还发现黄芪甲苷通过同时抑制铁下垂、铜中毒和氧化应激起作用。开发的PA成像探针和确定的候选药物为AKI的早期发现和有效治疗提供了一种潜在的新方法和工具。
Zhang等人还开发了一种新型成像探针BDP-KY，该探针对粘度变化敏感，利用NIRF和PA成像检测纤维化相关异常。他们利用该探针对大黄中大黄素-8-葡萄糖苷和大黄酚8- o -葡萄糖苷等中草药成分进行了评价，发现它们是潜在的抗肾纤维化药物。在单侧输尿管梗阻小鼠模型中，超声、PA和NIRF成像显示，不同浓度的这些化合物有效地降低了肾纤维化期间的黏度水平。组织学分析证实纤维化标志物、α平滑肌肌动蛋白和胶原沉积减少。鉴于它们的药代动力学特征，这些化合物有望解决目前治疗肾纤维化缺乏有效药物的问题。这项研究强调了BDP-KY在评估肾纤维化中的作用，并强调了大黄中已确定的成分在治疗这种疾病中的治疗潜力。
总结
这篇综述讨论了在AKI中准确检测肾脏生物标志物的重要性，AKI是一种复杂的健康状况，与高死亡率和发病率风险相关。确定肾损伤的具体阶段对有效治疗至关重要。该综述探讨了各种分子探针，重点介绍了用于监测AKI的基于探针的成像技术的最新进展。叙述首先强调AKI的患病率和复杂性，强调其对健康结果的重大影响。有必要提高选择性，特别是对基于蛋白质的指标。这篇综述强调了分子探针作为这方面有价值的工具的重要性。本综述的后续部分将深入探讨不同分子探针的设计、组成、类别和特征。值得注意的探针类别包括肾清除探针、多通道靶向探针、NIR-II响应探针和ROS响应探针。每个类别都进行了探索，提供了对其独特功能和监测肾损伤的潜在应用的见解。本文讨论了专门设计用于生物标志物鉴定和治疗肾损伤疗效评估的探针。在这种情况下，信号通路和肾毒性药物也被考虑。这些探针的综合检查强调了它们在深入了解肾损伤的分子机制和评估治疗干预的有效性方面的潜在效用。尽管基于分子的检测系统取得了进步，但挑战是公认的。非特异性结合力，如氢键，疏水相互作用，π−π相互作用，荧光探针和存在于生物流体中的化合物之间被确定为影响探针功能的潜在问题。需要提高选择性，特别是对基于蛋白质的指标。该评论指出，虽然概念验证研究很多，但分子成像从实验室仪器到商业可行技术的转变需要严格的临床试验。基于探针的检测系统在临床环境中监测肾脏损害的实际应用被视为一个长期目标，需要进一步验证和解决基本问题。最后，本文承认基于分子成像的肾损伤检测和治疗效果筛选的巨大潜力。这表明，通过生物发光或近红外纳米探针的发展，体内成像技术的进步，如减少自身荧光和增强光穿透性，可以在分子水平上有效地预测、预防和及时治疗肾损伤。综上所述，本文综述了分子探针在AKI中的应用，讨论了分子探针的分类、应用和面临的挑战。它预测了跨学科的努力，为未来在该领域的进步，迎合研究人员在分析化学，生物学和医学。叙述强调了分子成像在提高我们对肾损伤的理解和管理方面的重要作用。
参考文献
Recent Progress in Molecular Probes for Imaging of Acute Kidney Injury Muqadas Sitara,# Wangning Zhang,# Han Gao, Jiwei Li,* and Jiangwei Tian*，Chem. Biomed. Imaging https://doi.org/10.1021/cbmi.4c00024
Chem. Biomed. Imaging:分子探针在急性肾损伤成像中的研究进展
内容提要
急性肾损伤(AKI)是一种普遍而复杂的临床疾病，与发病率和死亡率升高有关，需要在全球范围内对肾损害进行细致的检测和监测。由于分子探针和检测器的敏感性、快速性和成本效益，生物医学对AKI的分子探针和检测器表现出浓厚的兴趣。生物成像技术在识别和量化AKI指标，增强诊断方法以及潜在地改进临床治疗以立即控制损伤方面发挥着重要作用。分子探针是药物筛选、发现肾保护成分、信号通路和药物肾毒性作用的重要工具。本文综述了分子探针的最新进展，强调了它们在肾脏清洁性、多通道检测能力、近红外ⅱ响应性和对活性氧的反应性等方面的卓越功效。这些探针为评估肾脏损害和评估药物的治疗效果提供了增强的好处，同时减少了毒性作用。此外，本文还探讨了该领域未来的潜力和挑战，旨在促进分子生物成像技术在肾脏疾病早期诊断和治疗中的发展和提高。
AKI的生物成像策略
现代医学严重依赖生物分子数据来诊断和监测疾病状态。这些数据不仅用于诊断目的，而且在评估药物和其他治疗干预措施的有效性方面也起着至关重要的作用传统上，使用昂贵的设备、复杂的设施和劳动密集型的方法，使用传统的临床方法(如质谱法、色谱法和酶联免疫吸附法)从体液中提取这些信息即使存在缺陷，有几种临床方法仍被认为是黄金标准，因为它们产生的结果非常精确和一致因此，迫切需要探索新的方法，为监测医学标本(如用于诊断的体液)中的生物分子、药物和副产品提供敏感、一致和具有成本效益的分析措施，并用于跟踪治疗干预措施建立用于检测AKI和筛选药物治疗效果的生物成像平台是当今推进临床实践的最流行策略之一。为此，各种生物成像技术，包括等离子体和电化学探测器，纳米颗粒的结合和各种生物识别成分(如抗体，适配体，分子印迹分子)被应用于提高探测器的诊断能力。
分子成像
分子成像，一种非侵入性的方法，证明了实时监测生物体疾病进展的能力。它有望对肾脏中的细胞事件进行纵向体内跟踪，为具有挑战性的基于静态分析的体外诊断技术提供了有价值的替代方案。而单光子发射计算机断层扫描，对比度增强计算机断层扫描，磁共振成像，和超声检查通常用于肾脏筛查，它们主要用于检测器官的解剖和功能变化，而不是特别有助于识别发生在早期阶段并导致aki的分子变化。光学成像用于跟踪动物模型中的疾病演变并反复探测分子事件化学发光成像和荧光/磷光成像是利用不同的化学或生物过程来实现精确测量的两种成像方法荧光成像在过去十年中取得了显著的进步。由于其高灵敏度、准确性、非侵入性、优异的时空分辨率和实时监测能力，它正在成为化学、生物学和医学领域越来越有用的研究方法。由于其紧凑的尺寸和灵活的可修改性，小分子荧光探针往往是非常重要的荧光成像方法。
许多生物活性分子的荧光探针的可用性，包括金属离子、硫醇、蛋白质/酶、pH、活性氧(ROS)、活性氮(RNS)和活性硫(RSS)，大大提高了我们对这些物种生物学的理解这是一种检测不同生物分子的非侵入性方法与传统方法相比，使用荧光探针可以实时连续监测活细胞中生物反应的表达水平和催化活性。这显示了巨大的应用潜力另一方面，化学发光的特点是通过称为化学激发的化学反应产生光，已经发展成为一种先进的体内生物成像和治疗方法。它可以成功地消除荧光技术中存在的背景自身荧光，因为它不需要外部光学刺激，为生物成像提供了非常准确的检测和信噪比本综述分为五个不同类别的分子探针，旨在引导读者了解这些不同类别荧光探针的最新进展。每个类别在检测和理解AKI方面都有特定的目的。如方案1所示，第一类涉及基于肾脏清除率的探针，它利用肾脏的自然过程进行检测，并利用荧光成像提供对AKI的实时洞察。
第二类侧重于多色荧光探针，提高生物成像精度。第三类探索近红外(NIR) II荧光探针，与早期的NIR- i窗口相比，它提供了卓越的成像质量，更高的信噪比和更深的组织穿透。第四类介绍ros响应探针，用于检测氧化应激，识别AKI的早期阶段并可能影响其进展。最后，第五类是用于高通量药物筛选、揭示肾保护成分、阐明信号通路和研究药物肾毒性作用的分子探针，代表了分子成像的前沿研究领域。
基于肾间隙的AKI成像探针
许多造影剂不适合临床翻译是由于体内成像时器官滞留引起的急性或慢性毒性。为了减轻器官滞留引起的毒性，了解这些药物的药代动力学特征并优化其体内清除途径至关重要基于肾脏清除率的荧光探针利用肾脏的自然过滤和排泄过程来检测和监测急性肾损伤(AKI)这些探针经常使用荧光成像技术来提供有关探针从体内肾脏清除的实时数据。Huang等人报道了一种先进的可肾清除激活双报告基因(ADR)的合成，用于造影剂诱导的急性肾损伤(CIAKI)的实时体内成像。ADR具有化学发光和近红外荧光(NIRF)信号通道，可被溶酶体损伤(NAG)和氧化应激(超氧阴离子，O2•−)特异性激活。。在活体小鼠肾脏中检测到O2•−和NAG水平的逐渐增加，在CIAKI后肾小球滤过率(GFR)和组织损伤显著下降之前，由于其特殊的肾脏清除率(24小时注射后给药剂量的80%)。ADR优于标准临床试验，可提前16小时(化学发光)和至少8小时(NIRF)显示CIAKI。同样，Huang等人引入了用于精确跟踪尿液消除的分子肾探针(MRPs)。这些探针使药物性AKI的原位光学成像成为可能。通过利用早期AKI指标，如O2•−、NAG和caspase-3来激活NIRF或化学发光信号，研究小组实现了活体小鼠肾脏分子事件的纵向成像。他们在临床表现明显的AKI之前观察到细胞凋亡、溶酶体降解和氧化应激。与以前的方法相比，MRPs可以至少提前36小时对顺铂诱导的AKI进行无创检测，超越了传统的尿液分析技术，为早期AKI诊断提供了有希望的临床应用。
为了实时成像肾脏中的ROS和RNS, Huang等人合成了两种具有高肾清除率的近红外化学发光报告细胞(ncr)。ncr的化学发光成分和肾清除增强剂分别是Schaap 's含二氧乙烷的改性双氰亚甲基- 4h -吡喃和β-环糊精单元。NCR1和NCR2分别对O2•−和过氧亚硝酸盐(ONOO−)有选择性地激活近红外化学发光。由于其高肾清除率和纳摩尔敏感性，ncr允许在肾毒性暴露期间对肾脏中的活性氧和氮(RONS)进行无创监测，并检测细胞中内源性RONS的细微过表达。当药物引起AKI时，与NCR2相比，NCR1的激活速度更快，这意味着O2•−和ONOO−的有序升高。
此外，排出的ncr的荧光可以用于AKI的尿液分析，有助于在组织学调查前至少24小时识别出RONS过表达。因此，本工作提出了超灵敏的近红外化学发光探针，并为将其转化为有效的体内器官检测显像剂提供了指导。
Zhang等人创建并合成了一种小分子PA探针(BDP-3)。他们发现，在生理环境下，BDP-3可以形成完全可清除的纳米聚集体。当BDP-3中H2O的百分比从40%增加到90%时，其水动力直径从0.64±0.11 nm增加到3.74±0.39 nm。此外，这种意想不到的变化与PA强度显著增加2.06倍有关。
因此，在PA成像中使用BDP-3为安全检测化疗、中药和药物对比治疗诱导的动物模型AKI提供了一种新的方法。与标准血浆指数测试相比，该方法显示出更高的准确性，表明在未来的临床诊断中具有重要的潜力Zhou等人开发了两性离子单分子半青氨酸(ZCs)作为药物性肾衰竭(DIRF)早期检测的可激活报告基因。他们通过整合烷基磺酸盐和季铵盐阳离子获得两性离子特性，从而实现最小的血浆蛋白结合(<5%)和高肾脏清除率(约96%)。它们的可激活报告基因ZCRR隐藏在caspase-8可切割的四肽中，在顺铂诱导的DIRF小鼠肾脏中有效积累，在caspase-8激活时发出近红外荧光信号。这使得肾内细胞凋亡的敏感检测比临床方法早60小时，从而可以精确评估细胞凋亡修复效果。这也为远程DIRF检测和通过光学尿液分析预测肾脏保护效果提供了潜力。
参考文献
Recent Progress in Molecular Probes for Imaging of Acute Kidney Injury Muqadas Sitara,# Wangning Zhang,# Han Gao, Jiwei Li,* and Jiangwei Tian*，Chem. Biomed. Imaging https://doi.org/10.1021/cbmi.4c00024
