内容提要
生物正交激活在药物释放中的发展为精确、安全的抗癌治疗提供了一条有前景的途径。然而，目前有两个重大限制阻碍了它们的临床应用:1)药物前体及其相应的激活剂需要单独给药，导致药物积累不良和潜在的副作用;Ii)依赖外源性金属或有机激活剂来触发生物正交激活，当扩展到活体动物时，往往表现出低效率和全身毒性。为了克服这些限制，研究人员开发了一种一氧化氮(NO)介导的生物正交共递送纳米组件TTB-NH2@PArg，该组件由前体分子(TTB-NH2)和两亲性聚精氨酸(PArg)组成。在TTB-NH2@PArg中，PArg既是TTB-NH2的自组装纳米载体，也是NO发生器。在肿瘤微环境(TME)中，TME特异性生成的NO作为气体激活剂，触发原位生物正交键形成，将TTB-NH2转化为TTB-AZO。这种肿瘤特异性的TTB-AZO不仅可以作为有效抑制肿瘤的潜在光热剂，还可以诱导荧光变化，从而实时监测生物正交激活。本研究提出了一种药物共递送方法，可以精确和安全地控制抗癌治疗的生物正交激活，提高癌症治疗效果，同时最大限度地减少副作用。
结果与讨论
TTB-NH2@PArg的合成、制备及表征
纳米粒子TTB-NH2@PArg由含邻苯二胺的TTB-NH2和两亲性PArg组成，TTB-NH2的合成路线在方案S1A(支持信息)中提出，首先通过Suzuki偶联反应得到化合物1。以n -溴琥珀酰亚胺(NBS)为原料得到化合物2，再用三苯胺修饰得到化合物3。化合物3随后被Fe/HCl还原生成化合物4 (TTB-NH2)。另一方面，根据前人文献(Scheme S1B, Supporting Information)，在Scheme S1B (Supporting Information)中描述了PArg的合成路线。TTB-NH2、PArg和中间体的产物通过1HNMR和HR-MS进行了表征。由于PArg具有良好的双致病性，随后通过纳米沉淀法将TTB-NH2包封PArg，得到了稳定的TTB-NH2@PArg纳米颗粒。TTB-NH2@PArg的形貌(透射电镜，TEM)和尺寸分布(动态光散射，DLS)。纳米颗粒直径≈158.2 nm，呈规则的球形，分布窄(PDI = 0.20)。在测试的15天存储期内，TTB-NH2@PArg稳定在150 nm左右。
使用商用NO试剂盒初步测定不同配方的NO生成，单独TTB-NH2在有或没有H2O2的情况下没有明显的NO生成，而单独PArg在H2O2环境下可以产生大量的NO，但在没有H2O2的情况下NO生成较差。正如预期的那样，在TTB-NH2@PArg中也检测到NO的生成，高剂量的H2O2诱导更高的NO生成。TTB-NH2@PArg经过n介导的生物正交键形成后转化为苯并三唑衍生物TTB-AZO。因此，首先采用高分辨率质谱(HR-MS)和高效液相色谱(HPLC)测定TTB-AZO的生成。在H2O2与TTBNH2@PArg共孵育1 H后，TTB-AZO在828.2035 ([M]+H +)处出现了一个明显的离子峰，而未反应的TTB-NH2在817.2246 ([M]+H +)处出现了一个离子峰。HPLC检测TTB-NH2和TTB-AZO的保留时间分别为7.12 min和8.45 min。H2O2处理1 h后，7.12 min峰值强度(对应TTB-NH2@PArg)下降，8.45 min出现一个新的峰值，与TTB-AZO的峰值相匹配。这些结果表明，n介导的生物正交键形成成功进行，导致在H2O2与TTB-NH2@PArg孵育下TTB-AZO的原位合成。
TTB-NH2、TTB-AZO和TTBNH2@PArg的吸收光谱所示。在含有2%二甲亚砜(DMSO)的PBS缓冲溶液中，TTB-NH2和TTB-AZO分别在460 nm和690 nm处有吸收带。作为对照，TTB-NH2@PArg具有相似的TTB-NH2吸收带(约460 nm)。TTB-NH2@PArg、TTB-AZO和TTB-NH2@PArg在H2O2存在下的荧光光谱。在690 nm激发时，TTB-AZO在852 nm处显示出明显的荧光带，而TTB-NH2@PArg单独显示出非常弱的荧光。相比之下，在H2O2处理下，在852 nm处观察到显著的荧光增强，这表明TTB-AZO是由NO介导的生物正交键形成的结果。此外，我们还得到了TTB-NH2@PArg荧光光谱对H2O2孵育的时间依赖性和浓度依赖性。经H2O2处理后，TTB-NH2@PArg在852 nm处的荧光强度随着时间的推移逐渐增加，在2 h后达到平稳期。此外，H2O2剂量越高，荧光强度也越高。TTB-AZO在TTB-NH2@PArg中与H2O2的生成谱(HPLC测定)。与H2O2孵育后，TTB-NH2@PArg逐渐生成TTB-AZO，累积释放百分比在2 h左右达到最大值。为了测试NO -生物正交键形成的特异性，分别将TTB-NH2@PArg与一些潜在的干扰物或不同的pH孵育。在852 nm处，只有NO的产生能诱导出明显的荧光增强，说明在生理条件下，这些干扰不影响NO-生物正交键的形成。此外，这种NO -生物正交键形成在pH 5 ~ 9范围内保持稳定。这些研究表明，NO介导的生物正交键形成可以诱导TTB-AZO的持续生成，并且产生的荧光信号可以用来跟踪TTB-AZO的生成。
NO介导的肿瘤和正常细胞的生物正交键形成
受NO在PBS溶液中介导的生物正交键形成的高效率和特异性的启发，我们研究了癌细胞和正常细胞中NO的生成和随后的TTB-AZO的原位合成。首先，用3-氨基-4-氨基甲基-2,7双醋酸双荧光素(DAF-FM DA)评价TTBNH2@PArg的NO生成;NO荧光探针)。与TTB-NH2@PArg孵育1 h后，A549细胞(癌细胞，高浓度H2O2)中检测到明显的绿色荧光(NO生成)，而3T3细胞(正常细胞，低浓度H2O2)孵育2 h后仍有微弱的绿色荧光。相比之下，单独在A549细胞中的TTB-NH2在孵育2 h后显示出较差的绿色荧光，而单独在A549细胞中的PArg显示出较强的绿色荧光。在3T3细胞中，H2O2预处理后TTB-NH2@PArg的荧光明显增强。为了证明其普遍适用性，我们评估了TTB-NH2@PArg在各种细胞中的NO生成(癌细胞:PANC-1、A549、4T1和HeLa;正常细胞:HEK-293和3T3)。所有癌细胞在TTB-NH2@PArg处理后都表现出良好的NO生成，而正常细胞则表现出最小的NO生成。以上结果表明，TTB-NH2@PArg由于细胞内高水平的H2O2，可以在癌细胞中有效生成NO，从而触发NO介导的生物正交键形成，从而原位合成TTB-AZO。
随后，通过荧光成像监测TTB-AZO的原位生成，以确认细胞内生物正交键形成的激活。在细胞内化TTB-NH2@PArg后，TTB-NH2的细胞内荧光(Ex: 460 nm;Em: 620 nm)在孵育0.5 h快速观察到，而TTB-AZO (Ex: 690 nm;Em: 800 nm)在相同条件下最小。孵育1 h后，TTB-NH2的细胞内荧光逐渐减弱，而TTB-AZO的细胞内荧光明显增强。随着孵育时间的增加，TTB-NH2的荧光变得更弱，在4 h后完全消失，而TTB-AZO的荧光在4 h时达到最大。与TTB-NH2@PArg相比，TTB-NH2(不含PArg)在孵育4 h后在620 nm处表现出更强的红色荧光，而在800 nm处(TTB-AZO)表现出最小的荧光。此外，TTB-AZO的荧光强度呈剂量依赖性趋势。A549细胞中显著的荧光变化表明TTB-NH2@PArg可以高效生成NO，随后有效的细胞内生物正交键形成，导致TTB-AZO的激活和生成。另一方面，3T3细胞(正常细胞)中TTBNH2@PArg的细胞内荧光仅在620 nm处观察到，随时间变化不明显。然而，孵育4 h后，在800 nm处没有明显的荧光，这是由于NO生成不良导致TTB-AZO生成的生物正交键形成失活。
NO介导的生物正交纳米组装对肿瘤和正常细胞的细胞毒性
在NO介导的生物正交键形成的有效体外激活的鼓励下，使用CCK8检测对不同癌症和正常细胞评估TTBNH2@PArg的细胞毒性。未进行激光照射的所有组对两种癌细胞(A549和HeLa)的细胞毒性均较差。激光照射后，TTB-NH2@PArg对A549和HeLa细胞有明显的细胞毒性，而对TTB-NH2细胞的细胞毒性很小，这是由于NO介导的生物正交键形成失活。在正常细胞(3T3)中，TTBNH2@PArg表现出较差的细胞毒性，但经过H2O2预处理后其细胞毒性恢复。因此，TTB-NH2@PArg在3T3细胞中由于H2O2表达较差，不能产生NO来触发生物正交键的形成，说明其在正常组织中的生物安全性较好。在定量上，TTB-NH2@PArg在激光照射(TTB-NH2@PArg + L)下对A549、HeLa和3T3细胞的存活率在相同浓度下分别降低到7.3%、6.8%和89.3%。随后，通过Calcein-AM/PI染色实验观察TTB-NH2@PArg细胞死亡情况(活细胞为绿色，死细胞为红色)。正如预期的那样，TTB-NH2@PArg + L处理的细胞表现出丰富的红色荧光和最少的绿色荧光，而其他配方中只有绿色荧光，这表明TTB-NH2@PArg + L的光热效应有效地杀死了癌细胞。Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)染色法观察细胞凋亡情况。在A549细胞中，TTB-NH2@PArg + L在相同条件下的凋亡率最高。该结果与CCK实验结果一致，进一步验证了TTB-NH2@PArg + L对癌细胞的高细胞毒性。
肿瘤靶向NO活化生物正交纳米组件的制备及体外NO活化研究
TTB-NH2@PArg作为一种纳米颗粒，其表面带有高度正电荷，可能与多种蛋白质和其他生物分子相互作用，导致其在体循环中的稳定性较低，在肿瘤组织中的药物蓄积较差。基于这些结果，我们选择带负电荷的HA来修饰TTB-NH2@PArg表面，形成TTB-NH2@HAPArg。此外，HA可以通过与癌细胞上过表达的CD44受体结合，提供积极的肿瘤靶向作用。DLS显示TTB-NH2@HA-PArg的尺寸分布略有增加至206.7 nm, PDI窄至0.059。TEM结果表明，TTB-NH2@HA-PArg具有规则的球形结构，电位降至−17.7 mV。涂上透明质酸后，TTB-NH2@HA-PArg的稳定性首先通过在各种介质(包括PBS、血清和血浆)中的大小分布来评估。TTB-NH2@HA-PArg的粒径分布在这些介质中1周内保持稳定的粒径分布，说明胶体稳定性较好。此外，还考察了TTBNH2@HA-PArg和TTB-NH2@PArg在不同浓度胎牛血清(FBS)中的稳定性。TTB-NH2@HA-PArg在高水平FBS中在200-220 nm范围内的尺寸分布是稳定的，而TTB-NH2@PArg在加入FBS后尺寸发生了变化，证实HA-coating能够有效增强血液循环中的稳定性。
随后，我们还评估了TTB-NH2@HA-PArg的一系列体外实验，如NO的生成、药物释放率、PTT效应、细胞摄取、TTB-AZO的原位生成。TTB-NH2@HA-PArg与未包被的TTB-NH2@HA-PArg在NO生成、药物释放率和PTT效应方面的结果相似。接下来，我们研究了NO的生成以及随后在癌症和正常细胞中TTB-NH2@HA-PArg中TTB-AZO的原位合成。与TTB-NH2@HA-PArg孵育2 h后，NO试剂盒检测到A549细胞有较强的绿色荧光(表示NO生成)，而3T3细胞有较弱的绿色荧光，与TTB-NH2@PArg一致。随后，利用荧光成像技术在TTB-NH2@HA-PArg中监测TTB-AZO的细胞摄取和原位生成。在A549或3T3细胞中孵育0.5 h后，快速观察到TTB-NH2 (620nm)的细胞内荧光。而在A549细胞中，培养4 h后可检测到TTB-AZO在800 nm处的荧光强度，而在3T3细胞中，由于原位合成TTB-AZO的NO生成较差，未观察到明显的荧光。此外，还采用CCK8法评估细胞毒性。，在A549细胞中，TTB-NH2@HA-PArg的细胞毒性略高于TTB-NH2@PArg。这些结果表明，在细胞实验中，透明质酸涂层对其功能没有明显影响。
体内药物分布、药代动力学和光热效应
我们首先评估了TTB-NH2@HAPArg的血液相容性。PArg和TTB-NH2@PArg具有较高的血液相容性，由于带正电荷，溶血率超过40%。然而，HA涂层后的纳米颗粒溶血率最低(小于2%)，这清楚地证明HA修饰可以有效地维持纳米颗粒在血液循环中的稳定性。随后，通过NO介导的生物正交键形成前后TTB-NH2@PArg的荧光变化，我们可以成像药物在肿瘤部位的分布和滞留，并观察TTB-AZO的原位生成。荷瘤小鼠静脉注射TTB-NH2@HA-PArg后，记录12 h的荧光图像。注射后1 h，肿瘤区域和腹部有明显的620 nm荧光信号(TTBNH2)。但随着时间的推移(2 - 6 h)，肿瘤信号逐渐减弱，到8 h时几乎消失。TTB-AZO在840nm处的荧光信号在2 h时首次出现，随着时间的增加，荧光信号逐渐增强，在注射后4-6 h左右达到最大值，与620nm处荧光信号逐渐减弱相吻合。重要的是，在840nm(对于TTB-AZO)的荧光在12小时后在肿瘤区域保持明亮，表明活性肿瘤靶向纳米颗粒在肿瘤组织中长时间保留。此外，切除肿瘤及部分主要器官的离体荧光图像。注射后12 h，肿瘤区域(TTB-AZO)在840 nm处检测到强荧光，代谢器官(肝脏和肾脏)荧光较弱。这一发现进一步证实了TTB-NH2@HA-PArg在肿瘤区域的积累和滞留。
为了检测TTB-NH2在动物水平上向TTB-AZO的转化，我们将TTB-NH2@HA-PArg静脉注射到荷瘤小鼠体内，然后在注射后6 h从离体肿瘤组织中提取间质液。该流体的HR-MS分析显示，分子离子峰为828.2032 (TTB-AZO [M + H]+)和817.2247 (TTB-NH2 [M + H]+)，表明TTB-NH2在体内成功转化为TTB-AZO。为定量分析，采用高效液相色谱法监测静脉给药TTB-NH2@HA-PArg后肿瘤及主要脏器中提取的TTB-AZO。TTB-AZO主要在给药初期在肿瘤组织中产生，注射后8 h内，TTB-AZO在肿瘤组织中的浓度逐渐升高，达到11.7±1.2 μg−1。注射后12 ~ 24 h, TTZ-AZO呈下降趋势，但仍维持在5 μg−1以上。相比之下，大多数主要器官在整个注射后期间都表现出极低的TTB-AZO浓度，只有代谢器官(肝脏和肾脏)在注射后结束时表现出低浓度的TTB-AZO。此外，采用标准方案研究了TTBNH2@PArg和TTB-NH2@HA-PArg的药代动力学。与TTB-NH2@PArg相比，TTB-NH2@HA-PArg具有较长的消除半衰期(t1/2)和较大的曲线下面积(AUC0-24)。这说明透明质酸包被明显地延长了药物的血液循环。此外，我们观察到，注射后24 h, TTB-NH2浓度较低，表明TTB-NH2可以在24 h内被代谢并从体内清除。
生物正交纳米组装的肿瘤抑制作用
然后，我们用A549异种移植肿瘤小鼠模型评估了NO介导的生物正交键形成的抗肿瘤效果。将G1-G7组(Saline, PArg, TTB-NH2, TTB-NH2@HA-PArg, TTB-NH2@HA-PArg, TTB-NH2@PArg + L, TTB-NH2@HA-PArg + L)尾静脉注射到小鼠体内，记录21天的治疗期显示了不同组21天的肿瘤体积评价。G1-G5组肿瘤生长迅速且不受控制，说明未经激光照射的PArg、TTB-NH2和TTB-NH2@HA-PArg无法抑制肿瘤生长。然而，在激光照射下，TTB-NH2@HA-PArg组的肿瘤抑制效果最高，这表明NO介导的生物正交键在体内被成功激活，对肿瘤细胞具有显著的细胞毒性。这些发现得到了肿瘤生长、离体肿瘤图像和肿瘤重量统计数据的进一步支持。通过监测不同组的体重变化进行生物安全性评价。总的来说，在21天的时间里，各组小鼠的体重都有轻微的逐渐增加，这表明本文所使用的配方的剂量在安全范围内。为进一步验证抗肿瘤效果，对不同组肿瘤切片及主要器官进行苏木精伊红(H&E)染色，结果见图。G7组肿瘤切片坏死面积大，活细胞较少，与其他组相比，尤其是G1-G4组。此外，G7组主要器官未见明显组织学损伤，说明我们的纳米组装物在正常组织中的副作用较差。最后，60%的小鼠在G7治疗后存活至60天，具有长期的抗肿瘤生长效果。这些结果证明了我们的纳米组件具有有效的肿瘤抑制作用，良好的生物安全性，并延长了小鼠的存活率。
单独给药和双组分共给药的体内评价
与单独给药相比，药物前体及其相应的激活剂共同递送的优势在辅助信息中提供。我们设计了一个由两种纳米颗粒组成的对照组，用于单独给药。一种是纳米递归体(TTB-NH2@HA)，它使用DSPE-PEG-HA装载TTB-NH2。另一种类型是纳米活化剂(PArg@HA)，它是用两亲性PArg自组装的，然后涂有DSPE-PEG-HA。两种纳米颗粒的尺寸均为≈210 nm, zeta电位为负，与TTB-NH2@HA-PArg的纳米颗粒特性一致。在A549细胞中，首次通过细胞内荧光成像检测到单独给药和双组分共递送的TTB-AZO的原位生成。分别给药TTB-NH2@HA和PArg@HA 2 h后，在A549细胞800 nm处检测到明显的TTB-AZO荧光信号。该信号比TTB-NH2@HAPArg的信号弱，表明TTB-AZO在双组分共递送的情况下更好地在原位生成。此外，流式细胞术定量分析显示，TTB-NH2@HA-PArg孵育后TTB-AZO的生成率达到34.3%，而TTBNH2@HA和PArg@HA孵育后TTB-AZO的生成率分别为20.4%，表明双组分共递送的优势。
随后，分别给药和双组分共给药后，通过体内成像监测TTB-AZO在体内的原位生成。单独给药时，将PArg@HA + TTB-NH2@HA静脉注射到A549荷瘤小鼠体内。注射后4 h, TTBAZO有明显的荧光信号，持续8 h以上，12 h后逐渐减弱。对于双组分共递送，也以相同剂量静脉注射TTB-NH2@HAPArg到荷瘤小鼠。TTB-AZO在注射后2 h检测到荧光信号，并随着注射后2 ~ 4 h时间的增加而增强。在肿瘤区域，两组分共给药的TTB-AZO在注射后各时间的荧光信号均比单独给药的荧光信号强。注射后12 h，将所有小鼠处死，解剖进行不同主要器官和肿瘤组织的离体成像，共给药系统肿瘤区域840 nm (TTB-AZO)荧光较高。这些结果表明，双组分共给药比单独给药产生更多的TTB-AZO，有利于体内治疗效果。
为了进一步证实双组分共递送的体内优势，我们对A549荷瘤小鼠进行了肿瘤抑制实验。将荷瘤小鼠分为PBS、TTB-NH2@HA + PArg@HA和TTB-NH2@HA-PArg三组，然后静脉注射。一次性给药后，在治疗15天记录肿瘤生长情况，TTB-NH2@HA-PArg组肿瘤生长抑制效果优于TTB-NH2@HA + PArg@HA组，离体肿瘤图像和重量进一步证实了这一结果。此外，各组体重显示各组均无明显副作用。这一结果清楚地表明，在生物正交激活中，双组分共递送比单独给药具有更好的治疗效果。
总结
总之，我们的研究提出了一种巧妙的NO介导的双正交纳米组件TTB-NH2@HA-PArg，它通过共同递送前体及其激活剂来实现高度特异性的肿瘤治疗。该纳米组件有效地在TME中产生丰富的NO，触发生物正交键形成，并产生PTT剂(TTB-AZO)，以精确消除肿瘤细胞。此外，这种NO介导的生物正交键形成也诱导了荧光变化，提供了TTB-AZO生成的真实信息。在系统给药TTB-NH2@HA-PArg后，体内生物正交键形成表现出高特异性，导致TTB-AZO的精确生成，以最大限度地发挥治疗功能，同时最大限度地减少副作用。目前的研究提供了一个通过前体和激活剂同时共递送的高效、安全的生物正交激活药物释放的概念验证实例，有望在不同疾病中发挥精确、安全的药物激活作用。总体策略也成功地将成像和治疗功能扩展到不表达NO作为生物标志物的器官。
参考文献
Nitric Oxide-Activated Bioorthogonal Codelivery Nanoassembly for In Situ Synthesis of Photothermal Agent for Precise and Safe Anticancer Treatment Bowen Li, Jianwu Tian, Chongzhi Wu, Zhiyao Li, Li Qiao, Zongliang Xie, Bo Song, Yi Shan, Siqin Chen, Yufu Tang, Yuan Ping,* and Bin Liu*, Adv. Mater. 2024, 2405502 https://doi.org/10.1002/adma.202405502
