内容提要
去甲肾上腺素(NE)是一种在抑郁症监测中起重要作用的神经递质。其含量的显著降低与抑郁症的严重程度呈正相关。因此，准确检测NE对于追踪抑郁症的发病尤为重要。为此，设计了一种激发波长和发射波长均位于近红外区的发光近红外荧光探针Cy-TPC，用于特异监测NE。Cy-TPC本身在690nm激发时几乎不发出荧光。NE与NE孵育后，NE的β-羟乙胺基会攻击Cy-TPC的碳酸盐，发生亲核取代反应，最终释放荧光团Cy-OH，产生768 nm的近红外荧光。Cy-TPC检测NE具有较高的选择性和可接受的灵敏度，为其在生物样品中的应用奠定了基础。Cy-TPC可用于监测PC-12细胞内NE的含量，并成功应用于抑郁症小鼠脑内NE的成像。
结果与讨论
探针的合成
本工作合成了一种可用于检测NE的点亮型近红外荧光探针Cy-TPC(激发和发射波长均位于近红外区域)。用氯硫酸盐保护策略取代Cy-OH的羟基，得到灭荧光探针Cy-TPC。与NE孵育后，NE独特的β-羟乙胺结构会攻击Cy-TPC的碳酸盐位点，持续发生二级亲核取代反应。最后，去除保护，释放近红外荧光团Cy-OH，随后点亮近红外荧光。Cy-TPC探针也成功用于检测PC-12细胞内NE的含量和胞吐。此外，该探针还能准确检测NE在体内的活性以及NE在抑郁症小鼠模型中的表达情况。
NE的光谱研究
在酸性条件下，通过光谱实验考察了探针CyTPC与NE在体外发生亲核取代反应的可行性。首先，研究了Cy-TPC (10 μM)在pH 5.0(含10% DMSO共溶剂)PBS溶液中的紫外可见吸收光谱和荧光光谱。Cy-TPC具有典型的D-π-A共轭结构，在667和725 nm处有两个吸收峰。由于硫代碳酸盐基团的猝灭作用，该探针在690 nm激发下几乎没有荧光，量子产率为0.06%。3.0 mM NE孵育40 min后，667 nm处吸收消失，810 nm处出现新的吸收峰。在690 nm激发下，768 nm处的荧光增强24倍以上(量子产率为1.7%)。
这些光谱变化主要归因于NE对硫代碳酸盐水解的特异性诱导。高分辨率质谱(HR-MS)数据和核磁共振测量证实了该传感机制:在Cy-TPC和NE的混合物中，在406.1829处发现了化合物Cy-OH ([C28H24NO2] +， calcd 406.1802)的显著阳性信号。NE孵育后Cy-TPC提取物的1H NMR谱与荧光团Cy-OH的1H NMR谱高度相似。因此，探针Cy-TPC的硫代碳酸盐苯基酯能特异性识别NE中的β-羟乙胺结构，是检测NE的发光近红外荧光探针。验证了Cy-TPC在体外检测NE的可行性后，优化了反应条件。首先考虑了Cy-TPC和NE的反应时间。Cy-TPC (10 μM)和3.0 mM NE在pH 5.0含10% DMSO的PBS中孵育0-60分钟，每5分钟记录一次紫外可见光谱和荧光光谱。随着孵育时间的延长，667 nm处的吸收逐渐降低，802 nm处出现新的吸收。同时，在690 nm处激发后，在768 nm处出现了明显的近红外荧光。当孵育时间超过40分钟时，802 nm处的吸收和768 nm处的荧光发射都趋于稳定，因此选择40分钟作为后续实验的孵育时间。
然后，孵育温度也从0到50◦C进行了研究。Cy-TPC (10 μM)和NE (3.0 mM)在PBS中不同温度孵育40分钟。随着孵育温度的升高，768 nm处的荧光强度逐渐增强。由温度依赖性发射可知，Cy-TPC的荧光强度在35℃时达到最大值。当温度进一步升高时，荧光反而降低，这可能是由于高温促进了NE的氧化。因此，优化了反应的pH值。在酸性条件下(pH值为4.0 ~ 6.0)，Cy-TPC与NE发生亲核取代反应，768 nm处的荧光显著增强。然而，在pH值大于6.0的中性和碱性缓冲液中，768 nm处的荧光强度迅速下降，在pH值为9.0时甚至可以忽略。这是因为NE在中性或碱性条件下被氧化，并且在Cy-TPC的碳酸盐位点无法识别亲核取代反应。因此，下面的实验在pH 5.0的酸性条件下进行。
最后，在优化条件下考察了Cy-TPC对NE的荧光传感性能。随着NE浓度从0到7.0 mM的增加，Cy-TPC在768 nm处的荧光发射逐渐增加。Cy-TPC在768 nm处的荧光强度与NE浓度在0 ~ 3.0 mM范围内呈良好的线性关系(Int.768 nm = 238.848 × [NE]-76.868, R2 = 0.993)。在多巴胺(结构与NE类似的神经递质DA)和其他氨基酸(Lys、Ser、Thr、Hys、Tyr、Glu、GSH和Arg)以及阳离子(Na+、K+和Fe3+)和阴离子(Cl、SO4 2-和HCO3)存在的情况下，Cy-TPC的荧光保持不变。这些结果表明，Cy-TPC的荧光只有在NE存在的情况下才会被点亮，从而实现了对NE的高特异性检测。
活细胞内源性NE胞吐的荧光成像
为了将传感技术应用于生物样品，需要对Cy-TPC的生物相容性进行研究。CCK-8法研究Cy-TPC对PC-12细胞的细胞毒性。将PC-12细胞以5 × 104的密度接种于96孔板中，在细胞培养箱中培养48小时。细胞贴壁后，分别在96孔板上加入不同浓度(5、10、15、20、30 μM)的Cy-TPC孵育2、4、6 h，用DPBS洗涤细胞后，加入10 μM CCK-8孵育24 h，测定细胞活力。即使与30 μM Cy-TPC孵育6小时，细胞存活率仍在90%以上，说明Cy-TPC具有良好的生物相容性和较低的细胞毒性。有报道称神经内分泌PC-12细胞具有将NE储存在酸性囊泡中的能力。上述光谱实验也证实了NE在酸性条件下是稳定的。因此，我们利用不同类型的肿瘤细胞来研究NE在其中的分布。Cy-TPC (10 μM)分别与PC-12、HeLa和Hep G2细胞株孵育40分钟，然后进行活细胞成像。只有PC-12神经细胞在近红外区有明显的荧光， HeLa和Hep G2细胞的发射强度明显较弱。从图4d可以看出，PC-12细胞的近红外荧光强度明显高于HeLa细胞和Hep G2细胞。以上结果证实PC-12细胞中含有大量的NE，可以用Cy-TPC探针检测PC-12细胞中储存的NE。
通过添加外源NE，证实PC-12细胞囊泡中储存了丰富的NE。将PC-12细胞用3.0 mM外源NE孵育30 min，再用Cy-TPC (10 μM)孵育40 min，进行荧光成像。可以明显观察到近红外辐射。同时，内源性NE与Cy-TPC (10 μM)孵育40分钟后也产生了显著的近红外荧光。荧光强度与外源性NE和Cy-TPC产生的荧光强度基本一致，说明Cy-TPC和PC-12细胞产生的荧光信号是由于内源性NE攻击Cy-TPC发生亲核取代反应，释放荧光团Cy-OH。并对PC-12细胞胞吐NE的荧光成像进行了研究。已经证明NE储存在PC-12酸性囊泡中。PC-12细胞在高浓度K+溶液中孵育30分钟后，用10 μM Cy-TPC孵育细胞，每2分钟进行一次活细胞成像，观察荧光强度的变化。随着孵育时间的延长，发射强度逐渐降低。这是因为随着高K+溶液的加入，细胞内外正电荷离子浓度不一致，从而产生动作电位，促进细胞胞外分泌，从而释放NE，降低荧光。而PBS组的荧光强度没有明显变化。高K+溶液孵育10分钟后，荧光强度明显下降，而相同剂量PBS处理的对照组荧光强度无明显变化。
外源性NE在小鼠模型中的荧光成像
为了证明Cy-TPC在体内成像的可行性，还对小鼠模型NE进行了荧光成像。如图6a所示，在小鼠左右臀部注射生理盐水和NE 10分钟后，在左右两侧原位注射Cy TPC (20 μL, 50 μM溶于DMSO)进行荧光成像。随着孵育时间的增加，右侧注射NE区的荧光亮度明显增强，75分钟后荧光开始逐渐减弱，这是小鼠自身代谢所致。左侧生理盐水注射区未见明显荧光变化。可以更直观地观察到左右区域的荧光强度变化。右侧注射NE区荧光强度明显增高，明显高于左侧注射生理盐水区。上述结果表明，Cy-TPC探针适用于体内NE的检测。
抑郁症小鼠脑内NE的荧光成像
利用Cy-TPC探针对小鼠模型外源性NE的良好检测性能，对抑郁症小鼠模型脑内NE含量进行了视觉检测。将探针Cy-TPC (20 μL, 50 μM溶于DMSO)分别注射到健康小鼠和抑郁小鼠的大脑中15-90分钟后，收集荧光图像。根据上述NE含量的降低，与抑郁行为有关。Cy-TPC在健康和抑郁小鼠体内的荧光强度随着孵育时间的延长而增加。孵育60分钟后，Cy-TPC开始在小鼠体内代谢。健康小鼠脑内的荧光强度明显高于抑郁小鼠，这是由于抑郁小鼠脑内NE含量明显降低所致。结果表明，Cy-TPC可以直观地检测小鼠脑内NE的动态变化，成为检测抑郁症患者的有力工具。
总结
我们设计了一种激发波长和发射波长均位于近红外区的发光荧光探针(Cy-TPC)，通过保护-去保护策略检测NE。Cy-TPC与NE孵育后，NE独特的β-羟乙胺结构攻击Cy-TPC的碳酸盐位点，使其发生亲核取代反应。该脱保护反应释放荧光团Cy-OH，在768 nm处荧光被点亮。体外实验结果表明，CyTPC对NE具有较高的选择性和足够的灵敏度(LOD为5.01 μM)。活细胞成像实验表明，Cy-TPC可以直观检测PC-12细胞内NE的含量，并监测PC-12细胞内NE的胞吐过程。此外，还证实了Cy-TPC探针在体内成像中的进一步应用，它可以通过产生近红外荧光快速识别体内外源性NE，实时检测抑郁症小鼠模型中NE含量的变化，成为未来监测抑郁症患者的有力工具。
参考文献
A lighting up NIR fluorescent sensing assay for norepinephrine and its application in the imaging of depressed mice brain Fei Zhang , Yi-Ao Song , Hongzhe Yan , Haifeng Yang , Zihan Liu , Zaifeng Li , Peng Zhang * , Caifeng Ding *，Sens.Actuators B Chem. 417 (2024) 136182 https://doi.org/10.1016/j.snb.2024.136182。
