内容提要
分子设计的概念，集诊断和治疗功能于一体，符合现代医学进步的大趋势。本研究通过将半花青碱染料与内质网靶向官能团(对甲苯磺酰胺)结合，在细胞和动物模型上合理设计了用于内质网靶向诊断和治疗的智能分子ER- zs。由于ERZS对黏度具有高度特异性的靶向内质网的能力，因此ERZS仅在与内质网结合后才显示出大量的荧光开启，而不依赖于其他生理环境。此外，ER- zs作为一种小分子，可以通过基于高内质网应激的肝脏成像来诊断非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。重要的是，ER-ZS是I型光敏剂，在光照射下产生O2●-和●OH。因此，在缺氧(2% O2)条件下，光动力治疗对肿瘤细胞内质网造成了严重的氧化损伤，激活了独特的焦亡途径，在异种移植肿瘤模型中显示出良好的抗肿瘤能力。因此，提出的策略可能会为NAFLD诊断和癌症治疗整合分子光学提供新的思路。
结果与讨论
ER-ZS的设计与合成及其粘度相关的光谱研究
为了实现ER黏度变化的荧光诊断，高效生成ps诱导的PDT活性氧，合理设计了半花青碱衍生物(ER-ZS)。不同极性和粘度溶剂的吸收光谱和荧光光谱显示，具有D -π-A结构的ER-ZS表现出类似转子的行为，这与一些经典报道一致。此外，由于单键旋转引起的ER-ZS分子内电荷的扭曲转移效应，使得ER-ZS在各种低粘度介质中的荧光几乎被消除。然而，在甘油(Gly)中，由于高粘度环境限制了ER-ZS的自由旋转，在620 nm处观察到明显的荧光峰(增加了163倍)。伴随而来的是颜色从紫色变为粉红色。荧光的“off-on”特性不受溶液pH(2-12)或各种分析物(包括氨基酸和蛋白质)的存在的干扰这表明ER-ZS对粘度具有良好的特异性和抗干扰性，对于有效监测生物环境中粘度的变化至关重要。为了最终证明荧光信号的产生仅与环境粘度的变化有关，我们检查了不同的溶剂体系。正如预期的那样，无论在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中如何改变典型脂溶性溶剂(EtOH或THF)的组成，荧光都不能被激活。相比之下，在Gly - PBS体系中，随着Gly分数(fG)从0%增加到99%，荧光强度逐渐增加，表明ER-ZS对粘度变化的敏感性。因此，我们假设ER-ZS可以满足体内ER黏度变化敏感监测的要求。
基于分子对接的ER靶向成像与靶向机制
对甲苯磺酰胺是一个经常被报道的靶内质网官能团。因此，为了验证ER- zs在细胞环境中对内质网的靶向性，我们在体外将几种无光谱串扰的商业细胞器靶向染料与ER- zs共孵育，并使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进行检测。在MCF-7和4T1细胞中孵育30分钟后，ER-ZS表现出出色的ER靶向能力。此外，ER-ZS(红色)和商用ER-TrackER Green®的共定位系数分别高达0.9586 (MCF-7)和0.9372 (4T1)，显著高于其他细胞器(线粒体:0.4958 (MCF-7)、0.4129 (4T1);溶酶体:0.3067 (MCF-7)， 0.3505 (4T1);细胞核:0.1196 (MCF-7)， 0.0090 (4T1))。为了进一步阐明ER- zs对内质网的精确靶向机制，利用AutoDock 4.0在原子水平上模拟了ER- zs与SUR1结构域之间可能的结合机制。磺胺类以其与内质网KATP通道上的SUR1结构域的高结合能力而闻名，例如格列本脲(一种糖尿病药物)。对接研究揭示了预期的相互作用，其中对甲苯磺酰胺不仅与SUR1结构域的ARG1300、TYR377和TRP1297发生相互作用，而且还建立了具有多个苯环和卤素原子的疏水菁氨酸结构与天然疏水蛋白袋(TRP430、GLN485、SER1138、HIS1135和THR1139)之间的相互作用。这些相互作用共同成为结合的驱动力。因此，整个分子与SUR1结构域具有较强的结合亲和力，结合能为9.9 kcal/mol。虽然ER- zs和商业染料一样，可以通过磺胺基修饰靶向内质网，但与具有“常亮”荧光的商业染料相比，具有黏性敏感(荧光关闭)特性的ER- zs在生物成像和诊断方面具有显著优势。如图2C所示，对于商用ER-TrackER Green®染料，在与细胞共孵育后未能执行洗涤步骤可能导致深厚的背景荧光，严重影响成像效果。相比之下，对于ER-ZS，在低粘度介质中没有荧光信号;荧光信号只有在ER- zs的单键旋转受到ER的黏度环境约束后才能被激活。因此，ER- zs可以实现ER的无清洗和精确成像。此外，成像信噪比分析进一步证实，ER-ZS在没有洗涤的情况下保持了较强的信噪比，这对于准确的生物成像和诊断至关重要。
活细胞内质网应激监测
受到内质网出色的靶向性和对黏度的敏感性的鼓舞，我们研究了ER- zs在活细胞中对各种刺激的原位和实时监测内质网黏度变化的能力。饥饿是诱导内质网应激和自噬的经典方法，它会导致内质网功能障碍，导致内质网内未折叠或错误折叠的蛋白质聚集，从而导致内质网粘度增加。因此，采用无营养培养基诱导4T1细胞饥饿。值得注意的是，为了同时跟踪内质网胁迫后自噬的发生，我们将缺乏荧光串扰的LysoTrackER Green®(λex=488 nm， λem =511 nm)与ER- zs (λex= 560 nm， λem =620 nm)孵育，记录不同时间点的共定位系数。不同时间间隔的CLSM图像显示，ER- zs的荧光强度随着饥饿诱导时间的延长而显著增加，表明ER- zs可以有效监测内质网胁迫期间内质网黏度的变化。此外，我们观察到LysoTrackER Green®和ER- zs的共定位系数在间隔4 h内稳定增加，表明ER诱导自噬并在诱导过程中被溶酶体吞噬。然而，当饥饿诱导时间超过4 h时，共定位系数开始下降，引起了我们的注意。时间分辨成像显示，饥饿诱导3小时后，溶酶体数量显著增加。第5小时，ER- zs与溶酶体呈几乎相同的圆形聚集体，表明ER被溶酶体吞噬。相反，在第8小时，ER-ZS荧光在溶酶体浓度高的区域消失，这是导致LysoTrackER Green®与ER-ZS共定位系数降低的主要原因。这可能是由于溶酶体中ER的完全降解以及随后从溶酶体中释放ER- zs。如此优越的监测内质网黏度变化和跟踪内质网自噬过程的能力，在常见的小分子内质网靶向探针中是罕见的。为了进一步扩大ER- zs在内质网黏度监测中的应用，我们采用了两种典型的内质网应激诱导药物——萨普sigargin和tunicamycin对细胞进行处理。随后，通过流式细胞术观察ER- zs的荧光强度变化，评估这些药物诱导内质网应激的能力。在相同的处理时间下，ER-ZS的荧光强度与药物浓度呈剂量依赖性。此外，thapsigargin诱导内质网应激的能力似乎比tunicamycin更强，导致更多的细胞群向更高的荧光强度转移。westERn blot分析也支持这一结论。GRP78是内质网应激的重要标志物。当内质网中蛋白质折叠受到各种诱导条件的抑制，蛋白质无法正常折叠时，GRP78表达上调，促进蛋白质适当折叠。在相同条件下处理的细胞中，thapsigargin诱导GRP78表达增加。观察内质网粘度的变化使ER- zs能够反映内质网中的应力程度，这些结果证明了这一点。
ER-ZS的ROS生成能力
ER-ZS是一种粘度敏感的荧光探针，是一种能够高效产生ROS的I型和II型PS，我们用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)、二氢hodamine 123 (DHR123)、羟苯基荧光素(HPF)和二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH)来评价ER-ZS产生1O2、O2●-、●OH和总ROS的能力，并以PS玫瑰(RB)作为对照。DPBF的降解速率表明，ER-ZS可以产生1O2，但其速率远低于RB。但辐照后，ER-ZS显著提高了DHR123和HPF的荧光强度。这与II型PS RB相反，II型PS RB不能产生自由基ROS，这表明ER-ZS主要是I型PS，可以有效地产生O2●-和●OH。此外，O2●-和●OH的高效生成使得ER-ZS的总ROS产量大大高于RB，这直接弥补了不能产生1O2的不足。此外，与仅消耗氧气的II型PS相比，I型PS在抗缺氧PDT方面具有固有的优势。因此，I型PS产生的自由基ROS可以有效参与细胞内Fenton反应回收氧气，从而减少PDT过程中对氧气的需求，实现缺氧下的有效治疗。
我们使用细胞内ROS成像来证明ER-ZS在活细胞中具有抗缺氧PDT能力，单线态氧传感器Green®(SOSG)由一个探针组成，该探针可以被1O2特异性氧化以发出荧光。在常氧(21% O2)和光照条件下，ER-ZS诱导细胞发出亮绿色荧光，而在缺氧(2% O2)条件下，几乎检测不到SOSG荧光信号。而用于检测O2 *、* OH和总ROS的指标DHE、HPF和DCFH在缺氧处理后仍能检测到荧光信号。这表明ER-ZS在缺氧条件下通过I型机制保留了产生ROS的能力。此外，在正常氧和缺氧条件下对活细胞进行的MTT实验也证明了这一点。即使在缺氧条件下，ER-ZS对细胞也表现出极强的光毒性。因此，这些发现表明，ER-ZS具有优越的抗缺氧PDT能力，这对于治疗实体肿瘤至关重要。
PDT介导的内质网损伤触发肿瘤细胞热亡机制的激活
为了探讨ER- zs激活氧化损伤后焦亡的具体途径，我们进一步深入研究了ER损伤激活焦亡的级联途径。细胞中的Ca2+主要储存在内质网中。因此，有理由相信，当ER- zs精确靶向内质网时，通过光产生的大量ROS可以充分损伤内质网并释放Ca2+。根据Fluo-3AM监测细胞内Ca2+浓度获得的共聚焦成像结果，在4T1或MCF-7细胞照射后，细胞内的绿点荧光随着时间的推移逐渐增加。这种荧光的增加伴随着细胞焦亡的特征泡形态的出现。这些发现证实，ER- zs有效地破坏内质网，破坏其储存Ca2+的能力，同时大大提高细胞质中Ca2+的浓度。在线粒体内膜的膜电位的驱动下，这些Ca2+继续在线粒体上积累，从而降低了它们的膜电位。ER-ZS+L中JC-1的红色荧光消失，绿色荧光增加，为线粒体膜电位消失提供了最具说服力的证据。此外，线粒体中过量的Ca2+可能会加重氧化应激，增加线粒体中超氧化物的数量。随后，线粒体超氧化物成像显示，超氧化物探针的荧光数量和强度也是时间依赖性的，表明线粒体在Ca2+过载后继续产生超氧化物。由于NLRP3是激活焦亡通路的关键组成部分，大量研究表明线粒体ROS是NLRP3的主要激活因子。因此，这一现象也解释了先前报道的NLRP3上调的结果。随后的荧光成像和westERn blot分析证实，NLRP3也激活了caspase 1，导致gasdERmin D (GSDMD)成功切割成GSDMD - n，随后肿瘤细胞焦亡。
体内抗肿瘤活性
最终，我们尝试通过ER-ZS实现焦亡治疗人乳腺癌(MCF-7)。为保证ER-ZS在肿瘤中有效富集，裸鼠采用瘤内注射治疗，每2天记录每组小鼠的肿瘤体积。(肿瘤组织成像结果，在瘤内注射ER-ZS后2 h进行PDT)。治疗周期结束时，PBS组和非光照组肿瘤生长迅速，ER-ZS+L对肿瘤的抑制率显著;ER-ZS+L组小鼠肿瘤体积最小。此外，在治疗期间，这些小鼠的体重没有显著差异。此外，对切除肿瘤组织的H&E、TUNEL和Ki67染色分析进一步表明，ER-ZS的PDT具有激活肿瘤焦亡的能力，可引起细胞大面积DNA断裂，显著抑制肿瘤增殖。同时，所有组的组织学分析未观察到其他器官有明显的形态学或组织病理学异常，这表明ER-ZS具有较低的暗毒性，因此可以对肿瘤部位进行光介导特异性治疗。
总结
本研究描述了一种新的多功能荧光染料ER-ZS，它可以通过两种不同的分子机制同时诊断NAFLD和治疗肿瘤。特别是合理设计的ER-ZS，通过抑制ER-ZS中单分子键的旋转，使荧光信号响应发生粘度变化。内质网的精确靶向可以实时监测内质网粘度的变化，从而实现内质网应激和自噬的视觉跟踪。经静脉注射ER-ZS后，由于其独特的性质，ER-ZS在小鼠肝脏中特异性蓄积，有助于NAFLD的诊断。与其他只能成像的荧光探针相比，ER-ZS具有优异的I型抗缺氧PS;生成的O2 *和* OH可以以低O2依赖性的方式有效地触发细胞内级联反应，从而降低PDT对O2的依赖。除了抗缺氧能力外，ER- zs还通过pdt介导的内质网级联途径激活一种新的细胞死亡模式(焦亡)，有效治疗肿瘤细胞，这在本研究中首次被发现。虽然目前对ER-ZS的研究仅限于细胞和动物模型，但未来的化学分子设计很可能以疾病诊断和治疗的综合分子设计为主导。因此，在未来，这种有希望的ER-ZS可能导致传统荧光探针或ps的单一功能模式的范式转变，并为疾病诊断和治疗提供新的见解。
参考文献
An ER-targeted, Viscosity-sensitive Hemicyanine Dye for the Diagnosis of Nonalcoholic Fatty Liver and Photodynamic Cancer Therapy by Activating Pyroptosis Pathway ，Shuang Zeng, Yang Wang, Chen Chen, Heejeong Kim, Xiaosheng Liu, Maojun Jiang, Yichu Yu, Yves S. Kafuti, Qixian Chen, Jingyun Wang,* Xiaojun Peng, Haidong Li,* and Juyoung Yoon*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202316487，doi.org/10.1002/anie.202316487
