内容提要
作为一种重要的细胞调控，铁死亡已被探索用于癌症的治疗，与可调节活性硫(RSS)有关。治疗性剥夺半胱氨酸(Cys)可诱导胰管腺癌的铁死亡，这给研究人员展示了医学翻译的前景。除了直接的胱氨酸转化外，Cys主要来自蛋氨酸(Met)的de novo去甲基化代谢。因此，探索Met的上游代谢可能为调控铁死亡提供可能。
结果与讨论
我们合成了两个探针MPC和BPC，并进行了验证。首先用质谱验证了其工作机理。BPC在650 nm光活化后释放中间体M1 (MS: 655.4100)，然后在缺氧和再氧化下分别产生M1 C(641.2600)和M1R(671.1800)，表明中间体遵循了这一策略。其次，我们用光学性质证实了这一机制。光激活后，790 nm和725 nm处的荧光分别减弱和增强。这个比例响应表明M1的产生，这与质谱一致。再次，模拟氧化还原微环境，进一步确认其工作机制。随着Hcy的增加，F725表现出有限的增强(约1.5倍)。而随着H2O2浓度的增加，荧光强度下降，说明中间M1的亚硝基转化为硝基，这与质谱一致。这些结果表明，低水平的Hcy和亚硝基的氧化使荧光强度很低。随着H2S的增加，F725明显增加(约7倍)，这是由于亚硝基的减少。添加Cys后，F725的活性显著增强(约20倍)。比较上述结果，我们发现BPC在缺氧和氧化应激下对模拟代谢物的荧光强度有很大的差异。为了进一步证实这种分化，我们模拟了从缺氧到氧化应激的转换。
结果表明，虽然Cys触发了荧光，但一旦H2O2增加，由于亚硝基的氧化，荧光明显下降(约5倍)。为了使结果更清晰，我们进行了比率分析。图中显示，在缺氧条件下，F725/F790增加了53倍，而在氧化应激条件下，H2O2和Cys的共同影响下，F725/F790只增加了4倍。因此，通过比较这些荧光比率，可以实现不同微环境之间的明显对比。考虑到探针与目标之间反应的随机性，我们用相反的序列检验了该探针的均衡性。Cys和H2S的增加引起了~18倍的荧光增强，H2O2引起了~4倍的荧光减弱。这些结果相当，尽管顺序相反。因此，该探针保证了不同路径的等价性，避免了复杂微环境下由于随机性造成的信号泛化。为了使结果更清晰，我们进行了比率分析。可以看出，F725/F790在缺氧条件下增加了51倍，而在氧化应激条件下仅增加了5倍，这与图中相当。为了最终确认这一机制，我们在上述条件下进行了质谱分析，发现M3和M5仍然是不同微环境下的最终产物。因此，上述实验表明，BPC通过不依赖通路的等性策略增强了缺氧和氧化应激之间的荧光对比。这非常适合在复杂的癌细胞或肿瘤微环境中进行分析。
根据上述外源实验，我们随后使用MPC功能探针检测内源代谢物。由于Met主要存在于血清中，因此MPC可以为细胞提供Met库，同时可以检测内源性Met代谢物。首先，我们通过将MPC与nem预处理的HepG2细胞孵育在缺氧条件下测试MPC。急性缺氧时，a1、a4、a7和a10 (725 nm通道)荧光逐渐增加，表明MPC释放Met导致Cys升高。而随着慢性缺氧，a13和a16的荧光进一步增强。这一结果应归因于Met代谢产物的升高。为了证实这一点，我们进行了质谱分析。显示检测到产物M5，表明荧光增强是由Cys和H2S同时产生触发的。次，我们测试了再氧化条件下的MPC。，从b1到b16，由于Met代谢的Cys升高，荧光强度逐渐增强。而与a组相比，b组的荧光较弱。这应该是由于再氧化过程中亚硝基的氧化所致。此外，再氧化下调了Cys，这也导致了荧光减弱。为了确认，我们进行了质谱检测。，检测到M1R与Cys反应生成的M3，说明在再氧化作用下，产物主要为M3。因此，质谱结果与荧光成像结果一致。再次，我们在铁死亡条件下测试了MPC。氧化应激导致c4和c7通道的荧光非常微弱。这应该是由于中间体M1中的亚硝基氧化所致。从质谱图也证实了这一点。有趣的是，除了M3，我们还在图中发现了OMPC的存在，这是MPC中蛋氨酸氧化的产物。即氧化应激导致Met氧化，从而使Cys水平降低，这是c10相对于b10荧光降低的原因。此外，随着氧化的增强，图中显示出较弱的荧光，表明Cys水平进一步降低。正如预期的那样，质谱显示，不仅可以观察到M3和OMPC，还可以观察到蛋氨酸完全氧化产物DOMPC。Met的完全氧化导致Met对Hcy的不可逆性，从而明显降低了Cys。在这种情况下，氧化应激与缺氧之间的荧光分化变大。此外，减少的Cys有利于Fenton反应，从而增加Met的氧化。从而增强荧光的区域分化。在慢性缺氧状态下达到峰值。复氧条件下，F725/F790低于缺氧条件下。此外，随着时间的增加，再氧与缺氧之间F725/F790的差异也越来越大。而在氧化应激下，F725/F790分化程度有所增加，特别是与Fenton反应的强氧化状态。作为辅助证实，F600/F790显示在这些微环境中荧光分化增加。因此，在缺氧、再氧化和氧化应激的微环境下，MPC表现出明显的分化。缺氧与复氧的串扰:考虑到肿瘤微环境的复杂性，我们在这两种情况的切换中进行测试。bo组与a组之间F725/F790的差异在缺氧切换到复氧后呈增加趋势。而在复氧向缺氧切换(br组)过程中，F725/F790明显增加，相对于复氧组(bo组)表现出明显的分化。600 nm通道的结果进一步证实了这一点。因此，上述MPC实验表明，功能探针可以在不同微环境中对内源性Met去甲基化代谢物表现出对比增强的荧光。由于Met的去甲基化代谢物和微环境因素都可以影响铁死亡，因此该探针策略特别适合于探索不同微环境下的差异化铁死亡。
基于以上结果，我们使用探针BPC在铁致光条件下进行差分成像。在缺氧条件下，725 nm通道显示出强荧光。600 nm通道(a3)荧光增强进一步证实了这一点。图中显示725 nm通道的弱荧光，表明Met的去甲基化代谢物水平较低。b3通道微弱的荧光强度也证实了这一点。当铁死亡处于氧化应激时，c1和c3的荧光进一步减弱，说明氧化应激下的铁死亡细胞中Cys的水平很低。为了清楚地显示这些微环境中不同的荧光，我们进行了比率分析。从缺氧到复氧再到氧化应激，F725/F790表现出明显的分化，图中也在F600/F790中表现出类似的趋势，作为证实。因此，在铁凋亡条件下，探针BPC可以表现出对比增强的荧光，以反映不同微环境下Met去甲基化代谢物的分化。综上所述，我们发现在氧化应激下，趋铁微环境导致Met的去甲基化代谢物水平较低。而作为回报，这样的结果可能更有利于铁死亡。为了证实这一假设，我们进行了过氧化物分析和蛋白质分析。从缺氧(a)、再氧化(b)到氧化应激(c)， C11-BODIPY荧光增强，表明过氧化程度增强。此外，从图中可以看出，GPX4表达的降低也支持了铁死亡的增加。因此，我们发现随着Met从缺氧到氧化应激的去甲基化代谢物的减少，铁死亡会增加，这可以通过差异荧光来反映，这为探讨铁死亡的潜在区域偏好提供了可能。
在肿瘤实验之前，我们用组织来验证其适用性。从缺氧到复氧，荧光呈现出明显的分化，通过图中的比例分析证实了这一点。这表明肝组织中的BPC反映了不同微环境下Met去甲基化代谢物的区域分化。考虑到血管是肿瘤发生发展的关键枢纽，我们在血管周围组织周围进行了缺氧和再氧的动态串扰实验。当血管处于缺氧状态时，近区荧光较强，F725/F790随着距离血管越远，荧光越弱。同时，在F600/F790中也表现出类似的趋势。这些结果表明，血液限制导致组织缺氧，从而增加Met的去甲基化代谢物，导致血管周围组织近区域的荧光更强。相反，在血管再氧化过程中，显示血管周围从近到远区域的荧光增加，这意味着血管再氧化过程中血管周围组织中Met的去甲基化代谢物减少。因此，在离血管近到远的区域，探针通过荧光对比增强反映了Met去甲基化代谢物的分化分布。图中显示了比例荧光在血管周围的统计分布。可见，在缺氧血管周围荧光比较大，且在100 ~ 600 μm(粘土滩)范围内呈下降趋势。在复氧血管周围，荧光比较小，在100 ~ 600 μm (wathet)范围内呈上升趋势。这些实验进一步证明了组织探针可以在不同微环境中响应Met的异质性去甲基化代谢物提供差异化荧光。为了突出对比，我们分析了正常组织和癌组织的相对荧光强度(F/ F0)。如图所示，缺氧时725nm通道的荧光是复氧时的约15.4倍，对比度令人满意。此外，600 nm通道的增强作为辅助确认。因此，上述实验证明了探针BPC在组织中增强区域分化以响应微环境和Met去甲基化代谢物的适用性。
在上述正常组织和血管实验的基础上，我们在癌组织中进行探索。分别在缺氧和富氧条件下采集肝癌组织。显示低水平的GPX4免疫荧光，提示低程度缺氧。因此，图中显示了725 nm通道的强荧光。相比之下，对于再氧化组织， 725 nm通道的荧光较弱。显然，BPC反映了缺氧和再氧作用下癌组织中Met去甲基化代谢物的差异。此外，600 nm通道(m3)作为辅助确认。图中的相对荧光强度对比为~23倍，表明两种微环境之间分化良好。此外，与正常肝组织相比，癌变肝组织的增强程度更高，这可能是由于癌变组织氧化应激加剧和缺氧所致。因此，有趣的是，探针更适合用于癌组织而不是正常组织。考虑到铁死亡状态总是与芬顿反应有关，我们认为探针在用于癌性肿瘤的铁死亡时可以提供对比度增强的荧光信号。
在体内实验中，我们希望探索不同微环境下Met去甲基化代谢物分化与铁死亡之间的关系，最终实现对铁死亡的区域调控。试验分3个阶段进行:
第一阶段:验证探针对铁死亡的体内适用性。与正常组(1)相比，缺氧组(3)和复氧组(2)的荧光分别较强和较弱。为了证实这一点，我们切除肿瘤进行成像，得到了相同的结果。这表明在缺氧条件下，Cys和H2S的水平更高，从而引发了更强的荧光。为了进一步证实，我们切开肿瘤切片进行影像学分析。从图可以看出，缺氧组(3)在600 nm通道荧光最强，复氧组(2)荧光最弱。因此，与上述体外组织实验一样，肿瘤中分化的荧光反映了不同微环境下Met去甲基化代谢物的变化水平。为了最终证实这一点，我们进行了质谱分析。可以看出，缺氧肿瘤的Cys水平高于复氧肿瘤，这与荧光成像结果一致。我们发现了[O-Met]和[O-Met- o]的强信号，说明在再氧化条件下，Met被芬顿反应的羟基自由基部分氧化为[O-Met]，再被氧化为[O-Met- o]。由于[O-Met- o]不能还原回[O-Met]，在这种情况下，有限的Met导致了低水平的Cys。此外，我们从探针和产物的角度对质谱进行了分析以进行确认。在低氧肿瘤中，M1C信号较高，而M1R信号很低。这表明肿瘤缺氧微环境主要将探针BPC转化为M1C的产物。同时，M3信号较弱，而M5信号很强，说明缺氧条件下Met的去甲基代谢物与探针中间体发生反应，产生了高荧光的M5。而在复氧肿瘤中，显示探针的主要中间体为M1R，主要产物M3很低。这是因为ROS将M1氧化为M1R，而Met的氧化使Cys减少，从而限制了弱荧光M3的产生。因此，结合荧光成像和质谱的结果，我们发现探针BPC在微环境和Met去甲基化代谢物的响应下，通过分化的荧光来区分肿瘤。由于这些因素和物种与铁死亡密切相关，我们检测了GPX4的蛋白水平。缺氧(3)时GPX4较高，再氧化(2)时GPX4较低。此外，我们进行免疫染色，发现再氧变化明显，缺氧变化微弱。这表明在缺氧条件下，Met的代谢产物参与了对铁死亡的抵抗。为了证实这一点，我们用C11-BODIPY进行了荧光分析。与正常肿瘤组织(1)相比，复氧肿瘤组织(2)的荧光较强，而缺氧组织(3)的荧光较弱。说明再氧化时脂质过氧化作用较强，缺氧时脂质过氧化作用较弱。此外，肿瘤大小可以看出，与正常肿瘤(1)相比，缺氧(3)的肿瘤较大，再氧合(2)的肿瘤较小。显然，这是由于较高水平的Cys和H2S限制了铁死亡，从而使肿瘤得以发展。相反，再氧化中较低水平的Cys和H2S对铁死亡有积极作用，从而限制了肿瘤的发展。因此，上述结果支持在铁沉条件下，探针BPC对微环境和Met的去甲基化代谢物均能表现出对比增强的荧光分化。
第二阶段:肿瘤切换微环境的鉴别成像。为此，我们在肿瘤局部微环境下进行了缺氧-复氧串扰实验。对缺氧小鼠的肿瘤注射烟酰胺(红色箭头)，使其局部快速再氧合。4 h后，分别向肿瘤两侧注射探针BPC。荧光成像图显示再氧化区弱强度(读箭头)，缺氧区强强度(绿箭头)。然后，在另一侧注射烟酰胺以引起局部再氧化。结果，荧光成像显示相反的分布，表明微环境和Met的代谢物也发生了改变。再次进行复氧干预后，该区域的荧光强度明显下降。这些结果表明，该探针可以灵敏地检测到铁致性条件下不同微环境下Met的异质代谢物，可以用于体内系统研究。
第三阶段:实现铁死亡的区域偏好和调控。基于上述实验，我们开始探索不同微环境下对差异化去甲基化代谢物的区域铁死亡偏好。荷瘤10天后，小鼠腹腔注射Erastin，分为α组(2因子对照组)、β组(1因子对照组)、γ组(慢性缺氧组)、δ组(再氧合组)和α组(缺氧-再氧合组)。行活体显像，检测肿瘤体积。图6y显示，α组肿瘤最大，说明在没有Erastin和微环境干预的情况下，肿瘤发育旺盛。β组由于Erastin的作用，肿瘤明显小于α组。而对于γ组，在慢性缺氧下， F725表现出最强的反应，表明在这种情况下Cys水平较高。相应的，肿瘤比β组大。显然，缺氧导致更多的Cys，从而抑制铁死亡。与γ组不同，δ组给予复氧干预14 d。其中F725最弱，相应的δ组肿瘤的发生最低。一致性再次表明，再氧化下调了Cys，从而降低了荧光并导致了铁死亡。比较γ和δ，我们发现它们之间有14倍的荧光分化。因此，该探针在区分erastin诱导的铁死亡过程中不同微环境中Met的区域代谢物方面具有重要的对比。受这些结果的启发，我们设计了一种调节铁死亡的方案，如下:1)对微环境进行成像，以显示是否有利于铁死亡;2)一旦荧光高，可对该区域进行干预，促进铁死亡;3)监测荧光，准确控制铁死亡。为了实施这一方案，我们采用对不利于铁下沉的微环境进行主动复氧干预的方法对组进行了实验。干预前(16 - 20天)，缺氧状态触发的荧光与γ组相当。根据该方案，强荧光反映了高水平的Met去甲基化代谢物，因此不利于控制铁死亡肿瘤。即需要对强荧光区域进行干预，从而改变微环境和代谢物，使其有利于铁死亡。而在复氧干预后(第22天)，荧光持续下降。荧光非常微弱，说明这种状态提供了氧化微环境和低代谢产物Met，有利于铁死亡。正如预期的那样，在再氧合干预下，肿瘤体积明显减小，证明了该方案的可行性。因此，通过探针和调控方案，我们可以实现Met去甲基化代谢物的微环境差异成像，找到需要干预的不利区域，从而通过调控铁死亡实现肿瘤的精准治疗。
总结
为了探索铁死亡的区域偏好以准确调控，我们设想了路径独立的等效策略和合成的荧光探针用于Met去甲基化代谢物的微环境差异成像。在功能上，探针的氧化还原选择性中间体确保了微环境(ROS;H2S)，数量选择性部分对Met的去甲基化代谢物(Hcy;半胱氨酸)。从逻辑上讲，这种与路径无关的均衡性与不同微环境中Met代谢的差异相匹配，这使得不同微环境之间的荧光差异显著，尽管反应顺序随机。即使对于由死铁引起的微环境氧化和Met氧化，对比度也被协同增强，避免了信号泛化。血管组织中分化荧光的动态成像证明了探针在微环境串扰下令人满意的实用性。肿瘤影像学显示，铁死亡倾向于再氧化或氧化应激的微环境，具有低去甲基化代谢产物Met。值得注意的是，铁死亡引起Met的氧化和Cys的减少，而Cys的减少又进一步促进了铁死亡。针对不利于铁死亡的微环境，我们提出了荧光成像-分化分析-化学干预方案，成功调控了铁死亡，控制了肿瘤的发展。我们相信，路径独立的等效鉴别成像和铁死亡的区域调节将有助于癌症的精确治疗。
参考文献
Microenvironment-differential Imaging of Demethylated Metabolites of Methionine for Identifying Ferroptosis Regional Preferences with Path-independent Equifinal Fluorescence Probes ，Yuanchao Zhang, Xinrui Ji,* Ping Han, Yuxia Liu,* Pu Chen, and Guang Chen*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202400459. doi.org/10.1002/anie.202400459
