内容提要
近红外二区(NIR-II)荧光成像(FLI)以其自身荧光低、组织穿透性强、分辨率高等优点得到了广泛的研究。近年来，光声成像(PAI)作为一种结合光学和声学优点的新兴成像方式，成为备受关注的研究热点。在此基础上，研制出能够同时进行荧光(FL)和光声(PA)双模成像的NIR-II探针，为探针技术的发展开辟了新的途径。同时也为其他成像方法的多模态联合应用提供了新的思路。一方面，综述了NIR-II型FL/PA双模成像探针的发展现状，包括探针的设计策略、探针的分类、可活化探针的发展以及在生物医学中的应用。另一方面，对此类探针的发展进行了总结，并展望了未来的前景和挑战。我们希望这篇综述能够激发读者的思考，帮助他们更好地将NIR-II FL/PA双模成像探针应用于生物医学领域。
NIR-II型FL/PA双模成像探头设计策略
根据探针分子信号变化的不同，NIR-II FL/PA双模成像探针的设计策略可分为“开-关”、“常开”、“关-开”和比例型四种。由于“开-关”探针本身具有较强的荧光，与被测物质反应后荧光减弱甚至消失，通常用于检测具有猝灭作用的生物标志物。此外，温度、氧气等环境因素也可能导致荧光猝灭，导致检测结果不准确。虽然这种探针分子更容易设计，但由于荧光衰减导致的低信噪比和低灵敏度限制了随后的生物应用。因此，本文着重介绍后三种类型的设计策略。“Always on”探针
“Always on”探针最初用于荧光成像。根据探针分子在正常和病变区域积累的浓度差异，捕获不同的信号强度，从而用于指示病变部位。这种探针需要连续发射信号，因此需要通过选择合适的荧光团来设计提供稳定的荧光信号。余辉发光材料通常用于“永远打开”探针的设计，因为它们能够在外部激励停止后继续发射光子。虽然探针不能选择性地激活特定区域内的荧光信号，但通过结合具有光激活特性的荧光团，可以提高其时空分辨率，从而能够精确观察特定区域的变化。改善探针的亲疏水性、生物相容性和尺寸效应有助于在体内靶向积累和渗透保留。由于“always on”探针在生物体中通过血液循环分布于全身各处，因此过度依赖于信号强度的采集，导致信号背景比(SBR)较低，容易产生虚假成像信号。随着成像探头技术的发展，结合光学和超声成像优势的PAI出现了，基于“永远在线”的NIR-II FL/PA双模成像探头也被开发出来。到目前为止，大多数NIR-II FL/PA双模成像探头都是“常亮”型。与传统的单模态“永远在线”探针相比，双模态NIR-II探针提供更高的分辨率和更深的组织穿透。同时，FL/ PA双模成像方法有效地提供了不同空间分辨率和不同深度的生物组织信息，从而提高了成像精度。
“关-开”探针
由于“永远打开”探针的局限性，研究人员开发了具有可激活功能的“关闭-打开”探针。与“常开”探针相比，“关开”探针不受探针分子浓度的影响，成像错误率低，灵敏度和特异性更高。然而，这些探针有局限性，如光稳定性差，易受环境波动的影响，难以定量检测。“开关”探针的设计策略包括可激活和聚集诱导发射(AIE)类型。可激活探针通过在其结构中引入特定的反应基团来检测疾病相关的生物标志物和微环境差异。常见的生物标志物包括阳离子、阴离子、活性氮(RNS)和活性氧(ROS)。微环境因素包括微酸性和缺氧。探针分子最初处于信号关闭状态，当受到病变微环境的刺激或与靶标发生特异性反应时，会产生易于区分的信号打开现象。基于NIR-II FL/PA双模成像的“关开”探针，可以通过无创成像实现对生物标志物和微环境因素的快速、可控、实时检测。“off-on”探针具有广阔的应用前景，为揭示疾病的发病机制提供了有力的工具。
2001年，Tang课题组首次提出AIE机制的科学概念。经过20多年的研究，基于AIE机制的“off”探针在化学、生物医学和材料科学中发挥着重要作用。探针分子在稀溶液中发光微弱或不发光，当分子发生聚集时，发光明显增强。AIE机制有效解决了传统有机发光材料面临的聚集致猝灭(aggregation-cause quenching, ACQ)问题，成为当前探针领域的研究热点。AIE机制的核心原理是限制分子内运动(RIM)。RIM可以进一步细分为限制分子内旋转和限制分子内振动，它们通过减少激发态弛豫来产生发光效应。常见的AIE荧光团包括四苯基乙烯(TPE)和三苯胺等，这些结构具有能够旋转的螺旋桨状构象。在光激发下，剧烈的分子内旋转导致激发态的能量主要通过非辐射衰变途径消耗。该工艺提供了高光热转换效率(PCE)，这是PAI的关键因素，因此AIE机制被广泛应用于NIR-II FL/PA双模成像。此外，具有AIE性质的分子在聚集时能够大大提高ROS的产生效率，从而为光动力治疗提供了平台。由于有机小分子的水溶性和稳定性较差，通常将具有AIE功能的探针分子制成纳米颗粒，以增加其在生物体中的生物相容性。基于AIE机制的NIR-II FL/PA双模成像探头，克服了传统光学成像中透光深度不足、荧光效率低等瓶颈，具有临床转化潜力。
比率探针
“Off-ON”探针通常使用单通道发射来实现目标的定性检测。相比之下，双通道或多通道发射的比例荧光探针具有自校准其内部信号的能力，避免了仪器参数和环境因素对实验结果的影响，提供了更准确的半定量和定量检测。比率探针作为一种强有力的生物医学工具，其未来的发展将集中在提高检测精度、优化生物相容性、增强稳定性和抗光漂白能力、实现多功能深度成像和临床翻译等方面。随着技术的不断进步和跨学科合作的不断深入，比例探针将在科学研究和临床应用中发挥至关重要的作用。在设计比率探针时，通常有两种策略。一种策略是引入一个对目标不敏感的参考信号作为内标，同时引入一个响应目标的传感信号，并对传感信号进行归一化，以实现比率测量。另一种策略是在探针分子中引入两种相关的响应传感信号，当探针分子与靶标发生反应时，其中一种传感信号增强，另一种传感信号减弱，从而实现信号可逆的比例检测。这种方法比带参考信号的比率法更灵活，SBR更低。目前，一些基于NIR-II FL/PA双模成像的比例荧光探针已经被开发出来。它们主要分为三种类型:FL比率法、PA比率法和FL/PA双比率法。NIR-II双模态比例成像不仅提高了体内成像的精度，而且提高了空间分辨率、时间分辨率和深部组织穿透性。除此之外，比率成像探针能够监测细胞内生物标志物的波动并对其进行定量分析。综上所述，比例探针对NIR-II FL/PA双模态成像对未来各种疾病的诊断和治疗具有重要意义。
NIR-II型FL/PA双模成像探头的分类
随着探针技术的不断进步，用于NIR-II FL/PA双模成像探针的材料种类呈现出持续增长的趋势。从有机小分子染料到有机纳米材料再到有机-无机纳米杂化材料，NIR-II FL/PA双模成像探针正在被大量构建。本节对构建NIR-II双模成像的有机小分子染料、有机小分子纳米粒子、有机-无机纳米杂化材料进行综述，并对各种材料的优缺点进行描述，希望为新材料的开发提供参考思路。
有机材料
有机小分子染料
有机小分子染料是具有小分子量的荧光化合物，在化学、生物学和医学等领域发挥着重要作用。这些染料具有易于标记、优异的光学性能和良好的可控性等优点。成像波长延伸到NIR-II区对有机小分子染料的顺序偶联程度提出了很大的挑战。共轭体系的增加降低了有机小分子的溶解度、稳定性和生物相容性。大多数有机小分子染料在有机溶剂中溶解度高，在水中溶解度低，限制了它们在生物系统中的应用。常见的有机小分子染料包括苯并噻二唑(BTD)、花青素和硼-二吡咯甲烷(BODIPY)衍生物。这些染料大多含有供体-受体-供体(D-A-D)推拉式电子结构，这种偶联体系可以很好地提高探针分子的生物相容性、光稳定性、发射波长和Stokes位移。用于NIR-II FL/PA双模成像的有机小分子探针结构大多为苯并噻唑和花菁。这些不同的化学结构不仅提高了探针的性能，而且为生物医学应用提供了高质量的NIR-II FL/PA双模成像。
2021年，Wang等人提出了一种能够携带内源性白蛋白的NIL-II FL/PA双模成像菁染料NIC-ER。采用苯并[c,d]吲哚取代吲哚绿羧酸(ICG-COOH)侧的苯并吲哚，合成了不对称菁菁染料NIC。随后，对其羧基进行修饰，并引入循环新生血管靶向肽和白蛋白结合基序，使分子能够主动靶向和携带白蛋白。NIC-ER在1030 nm处有明亮的NIR-II发射，荧光强度随着人血清白蛋白(HSA)溶液浓度的增加而逐渐增强。NIC-ER的高荧光强度和光稳定性为NIR-II FL/PA双模成像提供了基础。此外，探针分子可以聚集在肿瘤部位，用于观察肿瘤的轮廓。双模成像的相互印证也表明NIC-ER在肿瘤成像中具有很大的应用价值。Peng团队以苯并吲哚为受体，合成了三种单分子光敏剂，用于NIR-II双模成像。在分子中引入BTD的π桥结构，使得CyQN-BTT在NIR-II中具有较强的尾发射和光热稳定性。与cyye - tt和CyQN-TT相比，CyQN-BTT具有更加扭曲的结构，扭曲的分子内电荷转移机制使得探针分子更容易受到非辐射跃迁的影响，因此CyQN-BTT具有更低的荧光量子产率(QY)和荧光强度。水溶液比例增加时，分子聚集导致分子旋转受限，荧光强度明显增强，具有AIE特征。此外，CyE-TT和CyQN-TT结构中的正电荷提供了良好的线粒体靶向能力。CyQN-TT中的双电荷结构也专门针对癌细胞。NIR-II FL/PA双模成像能够准确成像小鼠肿瘤。
有机小分子纳米颗粒
由于有机小分子在体内的靶向性、溶解度和稳定性差，血液循环时间短，难以穿透血管到达病变部位，为了克服这些问题，纳米颗粒(NPs)成为近年来的研究热点之一。研究人员通过在有机小分子化合物的外部包覆DSPE-PEG、Pluronic F127等有机聚合物，设计出水溶性有机小分子纳米颗粒(OSMNPs)。OSMNPs的尺寸通常在1-100 nm之间，增加的比表面积和生物相容性使其更容易在生物体中分散和吸附，并通过循环系统快速渗透到组织器官中。OSMNPs也以多种方式合成，并利用有机小分子优异的光伏特性在NIR-II FL/PA双模成像中发挥了重要作用。然而，NPs容易在生物体中积累并产生某些毒性反应，因此开发低毒可降解的OSMNPs仍然是未来研究的重点。
2020年，Sun等人报道了一种基于AIE机制的新型NIR-II FL/PA双模成像探针ZSY-TPE。以吸电子能力强的苯并双噻二唑(BBTD)为核心，两侧的TPE和咔唑基为给体单元，形成了D-A-D结构的ZSY-TPE。TPE为探针分子提供了优异的光稳定性、较长的发射波长和较大的Stokes位移(290 nm)，能够减少生物损伤和背景干扰。由于连续的大共轭体系，探针的水溶性较差，当水溶液的比例为90%时，探针分子聚集强烈，荧光强度达到最大值。为克服ZSY-TPE水溶性差的缺点，采用表面活性剂DSPEPEG5000包封ZSY-TPE，形成ZSY-TPE圆点。此外，ZSY-TPE圆点还具有抗肿瘤和抗金黄色葡萄球菌的能力。与单模态成像相比，双模态NIR-II FL/PA成像能够对伤口细菌感染和抗肿瘤提供精确的指导。随后在2021年，Tang团队提出了三种苯并噻二唑-喹啉衍生物。其结构比BBTD型探针分子更加紧凑，增加了分子的稳定性，抑制了分子的迁移，有利于AIE机制。TPA-DPTQ在水溶液中表现出优异的AIE效果，但其发射波长仅为910 nm，限制了NIR-II成像。DPTADPTQ在水溶液中的分子间相互作用力影响其AIE效应，从而产生ACQ效应。只有DPBTA-DPTQ表现出NIR-II发射(1120 nm)和弱AIE效应。DPBTA-DPTQ采用两亲性的DSPE-PEG2000-FA制成纳米颗粒，具有优异的PCE，有助于FL/PA双模成像。dppbta - dptq NPs为光伏治疗提供了新的平台。最近，Lan等报道了基于半菁氨酸结构的NIR-II荧光探针M1，并通过DSPEPEG2000-NH2制备了水溶性M1 NPs。分子结构中含有强给电子二乙胺基和强吸电子氰基，形成了光热性质稳定的给体-π-受体结构。同时，两种可自由旋转的N, n二乙基氨基苯基增加了非辐射能量消耗，产生77.5%的高PCE。M1 NPs具有较长的发射波长和抗肿瘤作用。本研究为NIR-II型FL/PA双模成像光热剂提供参考。
共轭聚合物纳米颗粒
共轭聚合物(Conjugated polymer, CP)是一种新型的功能发光材料，具有单双键连续交替的π共轭体系。离域π键的形成，扩大了π电子的活度范围，使体系的能量降低，能级之间的间距变小，改变了材料的吸光性能和导电能力，具有比有机小分子更高的荧光亮度和光稳定性，广泛应用于荧光染料和光伏器件等领域。然而，CP在聚合中选择性较差，容易出现结构缺陷，影响材料的光电性能。另一方面，聚合物的扭曲形态也降低了分子内电荷转移的效率。因此，开发具有高光电转换效率和高稳定性的CP材料对生物成像领域具有十分重要的意义。为了在生物成像中获得更好的生物相容性，研究者将CP制成球形共轭聚合物纳米颗粒(CPNs)，并进行水分散。方案3概述了CP的化学结构和包覆两亲嵌段共聚物的类型。半导体聚合物纳米粒子(SPNs)是CPNs的一个重要分支，其高导电性在健康监测和医疗设备等应用中很有前景，但合成具有可拉伸性能和高迁移率的SPNs仍然很困难。
cpn具有优异的近红外吸收和光稳定性，在PAI中具有非凡的潜力。目前的cpn大多为单模态成像，因此NIR-II FL/PA双模态成像cpn的开发是有前景的。我们小组提出了一种基于吡嗪和噻吩结构的共轭聚合物SP，并与两亲性聚合物DSPE-PEG2000共沉淀形成SPN。SPN具有良好的NIR-II发射和光稳定性，在猪肉组织中的穿透深度为4mm。随后，我们的团队基于环戊二噻吩结构开发了共轭聚合物P-TT和P-DPP。纳米颗粒的制备也使用DSPE-PEG2000进行。与SPN相比，P-TT和P-DPP形成的cpn的荧光发射波长明显红移。此外，P-DPP具有更高的荧光量子产率(1.5%)和更大的组织穿透(8 mm)，使其成为一种有前途的NIR-II FL/PA造影剂。2022年，Xie等人利用修饰PEG spn和酚醛spn自组装，合成了NIR-II FL/PA双模成像纳米颗粒pfg - mpn。PFG-MPNs具有1063 nm的NIR-II发射和良好的溶液稳定性。随着PFG-MPNs溶液浓度的增加，FL和PA信号逐渐增强，表明其具有优异的NIR-II FL/PA双模成像能力。最重要的是，纳米颗粒被外泌体抑制剂和铁死亡诱导剂包裹，加速了肿瘤细胞的铁死亡，从而抑制了恶性肿瘤的生长和转移。
在这里，我们总结了用于构建NIR-II FL/PA双模成像的有机小分子染料、有机小分子纳米颗粒和有机-无机纳米杂化材料的各种参数(表1)。有机小分子纳米颗粒占了众多NIR-II FL/PA双模成像探针的绝大多数。大多数探针的发射波长只延伸到NIR-IIa '区，很少有探针能够在NIR-IIb区进行FLI。能提供更深入生理病理信息的NIR-II FL/NIR-II PA双模成像探针数量较少。多种生物医学应用具有巨大的研究潜力。此外，还需要进一步优化探针的粒径、QY和PCE，以提高探针的生物分布、组织渗透、细胞内化和体内稳定性。
可活化NIR-II FL/PA双模探针
可活化NIR-II FL/PA双模探针是一种具有特殊特性的材料，可以通过与靶分子反应而活化，产生不同的信号变化。目前报道的大多数可激活的NIR-II FL/PA双模成像探针都是“开-关”探针。这种探针可用于检测生物体中各种生物标志物的异常，并有望用于生物成像，药物筛选和疾病诊断。
NO活化探针
一氧化氮(NO)在人体中起着多种重要的生理作用。NO调节血管张力并具有抗炎作用。此外，NO还参与多种生理过程，如神经传递、免疫调节、细胞凋亡等，是体内最重要的信号分子之一。NIR-II FL/PA双模成像技术的FL信号可以定位和可视化生物样品中的NO水平，而PA信号可以用于定量分析。将这两种信号结合起来，可以获得更准确、更可靠的成像结果。然而，目前大多数NO活化探针的响应机制为不可逆键合反应，难以实现对内源性NO的原位检测和动态实时监测。
药物性肝损伤(DILI)可导致肝脏NO水平升高，因此NO被认为是DILI的直接生物标志物。Wu等设计了一种基于AIE机制的NIR-II FL/PA双模探针，用于检测中药致DILI。探针分子QY-N上的供电子丁胺结构能够削弱喹啉的吸电子能力，导致荧光猝灭。此外，丁胺是一种连接在芳香环上的仲胺，能够与NO发生n -亚硝化反应形成亚硝基，导致FL和PA信号“关闭”变化。采用纳米探针对雷公藤甲素所致肝损伤进行无创原位监测和跟踪。随后，在2022年，Wu的团队继续提出了用于NIR-II FL/PA急性炎症成像的无应答探针HC-N。与QY-N类似，HC-N上的供电子叔胺可以与NO发生n-亚硝化反应生成HC-NO。HC-N可通过NIR-II FL/PA双模态显像检测小鼠急性皮炎和关节炎模型中的原位生物标志物NO。HC-N为急性炎症的检测提供了有效的方法。比例荧光探针可以克服荧光自猝灭和背景信号干扰。Xiao等人开发了首款NIR-II FL/ PA双模比例探针RAPNP，用于NO检测。在弱酸性条件下，DTP-BTDA上的氨基能够被NO快速氧化生成DTP-TBTD，具有很强的分子内电荷转移效应，导致F127胶束中FL和PA信号被激活，吸收和发射波长发生明显的红移。作为内参的DTP-BBTD对NO没有响应，但可以提供950 nm处的光声信号和1120 nm处的荧光信号。RAPNP是首个基于二乙烯基吡咯结构的NIR-II FL/ PA双模成像探针，能够在炎症性肠病中进行比例检测内源性NO。同样，Chen等人利用探针分子BDNA上的o-二氨基作为反应位点，与NO氧化环化生成BDNANO。BDNA和2-羟丙基- β-环糊精能够形成两亲性配合物bda -h - βCD，并在水介质中自组装成纳米探针BNDA@HβCD。NIR-II FL/PA双模成像可实现toosendan和对乙酰氨基酚诱导的DILI小鼠模型的局灶定位。此外，BNDA@HβCD是内源性NO检测的有力工具，并成功实现了NIR-II FL/PA双模成像大豆芽内NO。
生物硫醇活化探针
生物硫醇是生物体内含有巯基官能团的非芳香族化合物。常见的生物硫醇包括硫化氢(H2S)、谷胱甘肽(GSH)、同型半胱氨酸和半胱氨酸，它们与生物体的多种生理病理过程有关。近年来，为了有效地检测和分析肿瘤微环境中的生物硫醇，研究人员开发了可激发荧光探针，通过标记不同的生物硫醇进行定量和局部分析。已报道的生物硫醇活化荧光探针的反应机制包括还原、迈克尔加成、芳香亲核取代、醛环化和硫解，它们利用巯基与特定化学结构相互作用产生荧光或光声信号变化。可活化NIR-II FL/PA双模探针是一种结合NIR-II FLI和PAI技术优势的新型生物硫醇检测方法，具有较高的灵敏度和选择性。Zhang等在2020年提出了NIR-II FL/PA双模成像系统，用于GSH和H2S的连续刺激反应。
在ABDS@BSA-N3 Nys中引入了三硫二烯丙基(DATS)和叠氮基(-N3)。肿瘤细胞的快速增殖产生大量具有抗氧化特性的谷胱甘肽，保护细胞免受氧化应激损伤。过量的GSH诱导DATS快速释放H2S，使带负电荷的-N3减少为带正电荷的-NH3，增加纳米材料在肿瘤微环境中的停留时间。纳米系统利用光声成像技术，结合了NIR-II荧光探针和光声造影剂，可以双重检测生物硫醇。Zeng等人提出了一种内源性h2s触发NIR-II FL/PA双模态智能纳米探针SiO2@Ag。H2S能够与探针中的Ag发生硫化反应，生成Ag2S纳米点，从而产生强烈的PA信号和红移的NIR-II开启荧光。SiO2@Ag可应用于结直肠癌中内源性H2S的特异性和高灵敏度检测，为结直肠癌的早期发现提供了一种新的成像方法。Gong等设计了基于花青素染料自组装和脱组装的可激活探针MC-PSE，用于GSH的体内NIR-II FL/PA双模成像。在探针中引入硒苯基作为特异性识别受体和荧光猝灭剂，能够在肿瘤部位与GSH发生亲核取代反应，导致NIRII的荧光和光声信号分别增强和衰减。MC-PSE是第一个实现体内GSH荧光和比例光声双模成像的NIR-II探针分子。Liu等于2021年开发了NIR/GSH顺序激活的纳米探针AsHMS-TA/FeIII@NK。该纳米探针由自然杀伤(NK)细胞膜和病毒样二硫键掺杂中空介孔二氧化硅AsHMS-TA/FeIII组成。当探针进入体内时，NK细胞膜阻止内部的AsHMS-TA/FeIII被免疫系统清除，并促进其在肿瘤部位的积累。在激光照射下，NK细胞膜发生劈裂，肿瘤细胞中过量的GSH通过二硫键断裂使AsHMs解体，释放出自由基引发剂(AIPH)，促进•OH和烷基自由基的产生，促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长。NIR-II FL/PA双模成像证实了纳米探针在肿瘤部位有效积累的能力。最近，Liu等报道了另一种具有高效AIPH加载能力的NIR-II FL/PA双模成像探头。研究人员创新地将Na2S2O8纳米晶体封装到空心四硫化物中，并将其引入介孔二氧化硅中，形成“蛋黄壳”状纳米系统Na2S2O8@HTSMSEF。在肿瘤细胞中，大量GSH的产生会裂解四硫化物并释放AIPH，促进硫酸盐自由基和•OH的产生，并通过多重氧化应激有效诱导肿瘤细胞凋亡，从而发挥抗癌作用。与AsHMS-TA/FeIII@NK相比，Na2S2O8@HTSMSEF在肿瘤部位积聚的时间更长，通过延长NIR-II FL/ PA双模成像可以更准确地确定肿瘤的位置、大小和形态。
ROS 活化探针
ROS是一类重要的化学活性氧分子，包括超氧阴离子、单线性氧、过氧化氢(H2O2)、•OH等。ROS在细胞代谢中起重要作用，是细胞内氧化还原状态的重要指标，可以改变代谢酶和转录因子的表达，从而影响细胞分化、增殖和炎症反应过程。此外，ROS也是机体氧化应激过程中产生的主要分子，长期以来被认为是肿瘤发生、发展和复发的重要因素。ROS激活探针是一种新的病变微环境检测平台，其中用于NIR-II FL/PA双模成像的ROS标志物主要是H2O2和•OH。NIR-II FL/PA双模成像探针弥补了传统ros激活探针发射波长短、组织穿透性差、体内成像困难等缺点。然而，ROS所具有的功能和机制尚未被充分发现，探针分子对ROS特异性检测的靶向性、选择性和抗干扰性有待进一步提高。2021年，Wu等提出了一种新型H2O2活化纳米探针BTPE-NO2，可用于间质性膀胱炎和肝脏缺血再灌注损伤的NIR-II FL/MSOT双模成像。BTPE-NO2两端的硝基苯氧乙酰胺基团不仅能猝灭荧光，还能识别H2O2。各种炎症性疾病的病灶部位产生大量的H2O2，能够诱导硝基苯氧乙酰胺基团的裂解和去除，产生特异性荧光信号，提高病灶部位检测的准确性。随后，Wu等基于花青素和BODIPY提出了四种H2O2活化荧光探针:TC-H2O2、BHC-Lut、PEG3-HC-PB、BX-BOH。TC-H2O2与H2O2的反应位点同样是硝基苯氧乙酰胺基团，其机理与BTPE-NO2相同。不同之处在于BHC-Lut的反应位点是硼酸键，而PEG3-HC-PB和BX-BOH的反应位点是苯硼基。
TC-H2O2、BHC-Lut和BX-BOH成功用于不同小鼠肝损伤模型的NIR-II FL/ MSOT双模成像。用增强生物相容性和亲水性的基团修饰PEG3-HC-PB，使探针能够被肾脏清除，在小鼠急性肾损伤模型中进行NIR-II FL/MSOT双模成像。这四种探针为不同类型的炎症成像提供了新的视角。Song的研究小组报道了一种ros响应的NIR-II FL/PA双模成像探针BBT-IR/Se-MN[150]。探针分子上的吸电子硝基能够通过提高肿瘤细胞中的ROS水平来增强放射治疗的效果。同时，ROS对分子中的二硒化物进行裂解，产生NIR-II比值荧光信号的变化。PAI证实缺氧程度与肿瘤大小呈正相关。该探针不仅可以预测原位胶质瘤早期放射治疗的疗效，还可以实时定量监测ROS水平。此外，Song的研究小组还报道了血浆h2o2活化探针Ag/Ag2S JNPs。在激光照射下，Ag和Ag2S之间的电子补偿效应使荧光“关闭”，当Ag在损伤部位被内源性H2O2氧化为Ag+时，电子补偿效应减弱，Ag2S NPs的荧光开启。探针在NIR-II FL/PA双模成像中的优异性能使其能够在体内无创地定位炎症和肿瘤。除了检测内源性H2O2外，Ye的团队还报道了一种•oh活化的NIRII FL/PA双模成像探针1-NP。1-NP负载一种二烯电致变色材料1-Br-Et，该材料可在肿瘤中被•OH氧化并带正电生成2-NP。由于探针分子与•OH反应，吸收和光热效应增强，导致NIR-II FL/PA双比值信号改变，促进了肿瘤内源性•OH的实时、无创成像。1-NP具有高度的选择性和敏感性，检测限低至3.69 nM，可以准确检测出在erastin诱导的铁死亡和放射治疗期间的•OH水平。
pH活化探针
pH值是维持生物体内环境平衡的关键因素。首先，体内酸碱平衡是生物体进行正常生命活动的重要保证。例如，过酸或过碱性的环境会影响蛋白质合成和能量转化等基本生命活动，从而威胁到生物体的生存。其次，pH值还会影响机体的免疫系统、神经系统和循环系统等。例如，过酸的环境会刺激呼吸系统，导致呼吸加快，同时刺激胃酸分泌，引发胃溃疡等疾病。相反，过度碱性环境可能引发皮肤瘙痒、发红、肿胀等症状，甚至可能导致休克。为了检测细胞和组织内的酸碱度变化，研究细胞代谢、细胞信号传导、肿瘤和其他疾病机制，研究人员开发了用于NIR-II FL/PA双模成像的pHactivatable探针。NIR-II成像可以弥补NIR-I成像的穿透深度和分辨率低等缺点。目前，大多数可pH激活的NIR-II FL/PA双模成像探针的外表面含有酸反应物质，这些物质在肿瘤细胞的酸性微环境中会发生分解。由于肿瘤细胞内外pH值波动较小，因此进一步设计高灵敏度、窄阈值的pH响应探针具有重要意义。
Chen等人设计并制备了一种ph响应的自组装纳米囊泡混合等离子体AuNNR-DCNP。这些囊泡能够在酸性条件下发生裂解，释放出纳米缺口的金纳米棒和DCNPs，以增强光学效果。具有高糖酵解活性的肿瘤细胞可以特异性地摄取和酸化AuNNR-DCNP，产生强烈的NIR-II FL和NIR-II PA信号，从而实现肿瘤可视化的精确定位(。Lv等人提出了一种由纳米缺口金纳米粒子(AuNNPs)和Ag2S量子点自组装的杂化囊泡AuNNPs-Ag2S。由于金纳米粒子在自组装过程中存在较大的局域表面等离子体共振效应，导致Ag2S量子点的NIR-II PA信号增强，NIR-II FL信号猝灭。AuNNPs-Ag2S外表面包被在肿瘤酸性条件下可降解的pHsensitive聚合物，等离子体偶联反应消失，NIR-II PA信号在AuNNPs中减弱，而NIR-II FL信号在Ag2S量子点中增强。这种杂交囊泡使肿瘤的NIR-II FL和NIR-II PA双模成像以及精确放射治疗成为可能。Wang等人基于dna编码策略组装了一个pHactivatable NIR-II FL/PA双模成像探针cu - 1。研究人员将具有ph响应特性的i-motif连接器引入cu -i，使其能够在酸性和中性条件下进行可逆组装。cu - 1能够穿透肿瘤血管，到达血管外的肿瘤实质，实现NIR-II FL/PA对深部组织的双模成像。此外，dna编码合成的Ag2S量子点能够被肾脏清除，从而降低生物毒性。与传统的NIR-II FL/PA双模成像探针相比，基于dna编码策略组装的探针具有更智能、更清晰、更精确、更高效的成像能力。Xu等人提出了一种具有pH响应肿瘤微环境的镧系掺杂上/下转换平台ldac，用于NIR-II FL/PA双模成像。ldac的外表面有一层碳酸钙(CaCO3)涂层，能够在肿瘤pH值下降解并产生二氧化碳(CO2)气泡。NIR-IIb FL信号随着CaCO3的降解逐渐增强。由于CO2气泡引发的惯性空化效应，负载在纳米探针内的Au NPs的PA信号也得到增强。ldac的发射波长在NIR-IIb区域，这使得信号自增强双模肿瘤成像成为可能。
NTR活化探针
硝基还原酶(Nitroreductase, NTR)是参与细胞能量代谢的重要酶，可催化硝基化合物还原为相应的胺，其活性受缺氧环境的强烈影响。NTR在生物体中具有重要的生理功能，如参与氮代谢和抗氧化应激。近年来，NTR在生物医学领域的应用逐渐受到重视，特别是在药物合成、生物传感、疾病诊断等方面。在实体瘤中，由于血管供应不足和细胞过度增殖导致缺氧，导致NTR水平升高。因此，NTR可以作为实体肿瘤的特异性标记物，用于开发NIR-II FL/PA双模成像的可激活探针。这些探针在动物模型中显示出良好的成像效果，有望成为实体瘤诊断和治疗的有效工具。然而，这些探针的设计仍然存在局限性，缺乏针对特定病变器官的能力。很难赋予探针良好的分子大小和脂溶性，使其能够轻松地穿过血脑屏障，用于检测脑内NTR异常引发的疾病。除此之外，在平衡FL和PA信号强度以提高生物成像的适用性、准确性和可译性方面仍然存在挑战。
2018年，Cai等人将NIR-II染料与ntr响应配体连接，合成了有机小分子探针IR 1048-MZ。硝基咪唑部分在探针分子上的吸电子感应效应能够衰减探针的NIR-II FL/PA信号。在肿瘤缺氧环境下，NTR能够将硝基咪唑部分上的硝基还原为一个氨基，产生IR 1048-MZH，从而增强了NIR-II的FL/PA信号。IR 1048-MZ具有组织穿透深、空间分辨率高、自身背景荧光低的特点，有利于NIR-II FL/PA对缺氧相关疾病的双模成像。Wu等设计了一种ntr活化纳米复合探针BHNO2@BSA，将具有AIE特性的NIR-II FL成像技术与MSOT光声成像系统相结合，实现对早期肝癌的原位检测。二苯胺上强吸电子的硝基在肝脏肿瘤缺氧环境下，能被NTR还原为供电子的氨基，产生强烈的NIR-II FL/PA信号。纳米复合探针在体外和体内均表现出良好的生物相容性和高对比度NIR-II FL/PA双模态成像。此外，通过动物实验验证了该探针在肝脏肿瘤术前定位和术中导航中的潜在应用。随后，Wu等提出了具有相同亲本结构的ntr响应型荧光探针NP-Q-NO2。
与BH-NO2@BSA不同的是，该探针上的硝基被NTR还原为氨基，促使醚键的自诱导消除反应产生羟基。NP-Q-NO2具有高选择性和稳定性，可实现NIR-II FL/PA双模成像乳腺癌远端器官转移，为检测肿瘤微环境中NTR异常提供有力工具。Zheng等构建了一种周期性增强的NTRresponsive nanoprobe, CGH NAs，用于通过双致敏策略精确激活NIR-II FL/ PA双模成像引导肿瘤协同治疗。探针表面包被一层2-硝基咪唑，在肿瘤细胞内可被NTR还原为水溶性的2-氨基咪唑。同时，HA分解释放CQ4T和GOX，并产生大量能够杀死肿瘤细胞的ROS。这种双重增敏策略可以提高治疗效果的准确性和可靠性，为NTR在不同肿瘤缺氧阶段的高敏感反应提供了一种新的解决方案。
其他活化探针
除了上述可激活的NIR-II FL/PA双模成像探针外，还有少数探针能够检测其他疾病相关的生物酶。近年来，双响应探针在环境监测、生物分析和医学成像等领域发挥了重要作用，其设计和应用是一个充满活力和挑战性的研究领域。在这里，我们介绍了用于NIR-II FL/PA双模成像的其他可激活探针。Fu等人提出了一种凋亡酶caspase-3响应NIR-II FL和NIR-II PA双模成像探针，AuNNP@DEVDIR1048。探针分子本身不具有FL和PA信号，在x射线照射下，诱导产生的大量ROS激活了caspase-3。激活的caspase-3能够特异性切割肽链，释放NIR-II荧光染料IR-1048和AuNNPs聚集体，从而打开NIR-II FL和NIR-II PA信号。AuNNPs聚集体可导致局部表面等离子体共振效应增强，从而使探针的吸光度和PA信号强度分别减弱和增强。Caspase-3还能诱导肿瘤细胞凋亡，使肿瘤体积变小)。综上所述，这种可活化的有机-无机杂化纳米复合材料可用于开发新的治疗系统，并实现早期疗效评估的目标。氨肽酶N (APN)促进肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。Chen等人介绍了一种可活化apn的纳米探针TX-APN@BSA，用于NIR-II FL/PA双模成像。通过肿瘤中APN的过表达，TX-APN上的丙氨酸能够转化为氨基，从而使探针的NIR-II FL/ PA信号通路被打开。探针双模成像可以准确描绘肿瘤原位位置，追踪淋巴转移。Wu的团队设计了一个pH/H2O2双响应的NIR-II FL/ PA双模成像纳米系统，QM@EP。该纳米系统可以在结肠pH下发生裂解，释放出内部探针分子QY-SN-H2O2。探针分子上的五氟苯磺酸盐能够被结肠内壁产生的H2O2裂解生成羟基。激活后的QY-SN-OH具有AIE效应，可增强NIR-II FL/PA信号，可用于体内溃疡性结肠炎的检测。Wu等还提出了另一种基于BODIPY的pH/ H2O2双响应NIR-II FL/PA双模成像纳米系统BM@EP。BM@EP在pH > 7的结肠环境中释放探针BOD-XTDHM。与QY-SN-H2O2不同，BOD-XT- dhm上的硼酸酯键能够被H2O2分解形成BOD-XT，导致光致发光电子转移过程受阻，NIR-II FL/PA信号增强。Zheng等报道了成纤维细胞激活蛋白(FAP)和H2O2双响应的NIR-II FL/PA双模成像纳米系统PPAC。Pd纳米片上的FAP反应肽能够被肿瘤间质成纤维细胞中过表达的FAP特异性切割，释放出BSA-CQ4T，从而开启NIR-II FL信号。此外，负载在纳米平台上的Ag也被H2O2释放并氧化为Ag+，从而产生比例化PA信号的变化。PPAC主要由肝脏和肠道清除，是一种很有前途的双激活NIR-II FL/PA双模成像系统。
结论与展望
NIR-II FL/PA双模态成像探头是一种先进的生物医学成像技术，结合了NIR-II FLI和派两种模态的优点，为疾病的诊断和治疗提供更准确的信息，与传统的单模态成像技术相比，NIR-II FL/PA双模态成像具有更高的灵敏度和特异性，可提供高对比度和高分辨率的生物成像，此外，该技术具有无创、高保真、高时空分辨率等特点，可以在不影响生物体正常生理功能的前提下，对活体组织和器官进行实时动态监测，NIR-II FL/PA双模态成像探头的研制对于深入了解生理过程和疾病机制具有重要意义。
参考文献
Recent advances in NIR-II fluorescence/photoacoustic dual-modality imaging probes Wei Pan a,b , Muhammad Rafiq , Waqas Haider , Yuanyuan Guo , Huinan Wang , Mengyuan Xu , Bing Yu * , Hailin Cong * , Youqing Shen ，Coord. Chem. Rev, 2024, 514，215907，https://doi.org/10.1016/j.ccr.2024.215907.
