内容提要
有机荧光团是细胞、组织和体内成像不可缺少的工具，并在广泛的生物和生物医学领域取得了很大进展。现有的许多染料存在吸收和发射波长短、亮度低、稳定性差、Stokes位移小、渗透率不合适等性能不足，制约了其在先进成像技术和复杂成像中的应用。在过去的二十年里，人们为提高荧光团的这些性能做出了许多努力。本文从荧光团的发光原理出发阐明传统荧光团性能不足的机理，系统总结了性能优化的改进方法，重点介绍了改进后的荧光团在成像和传感领域的典型应用，指出了该领域存在的问题和挑战。这一进展不仅证明了提高荧光团性质的意义，也为高性能荧光团的开发提供了理论指导。
传统染料性能的理论基础
传统的荧光团结构不同，但其发光原理是一致的。在光子激发下，荧光团可以从基态(S0)过渡到多个激发态(Sn (n>1))或第一个单重激发态(S1)。根据Kasha法则和frank - condon原理，Sn的高能级荧光团会通过振动松弛回到Sn的低能级。当Sn的低能级与Sn 1的高能级重叠时，荧光团通过内部转换转移到Sn 1的高能级而没有能量损失。振动松弛和内部转换的发生是重复的，直到荧光团达到S1的最低能级。S1中的一部分荧光团通过辐射(荧光)或非辐射方式返回到S0。另一部分可以通过系统间交叉(ISC)进入三态激发态(T1)而没有能量损失。换句话说，在这个过程中有三种能量的耗散形式，辐射、非辐射和向T1态转移。理论上，S1态和S0态之间的能隙越大，辐射释放的能量越多，发射最大值越短，荧光亮度越强。非辐射能量损失的过程是复杂的。两个确定的原因是扭曲的分子内电荷转移(TICT)形成和荧光团与介质分子之间的相互作用。此外，自聚集也会由于聚集引起的猝灭而导致亮度降低。斯托克位移与振动松弛有关，并随着振动松弛中能量损失的增加而逐渐增大。T1态的荧光团会通过振动弛豫达到T1态的最低能级，然后以磷光的形式释放能量。许多研究表明，大多数荧光团的光漂白涉及高能量(> 1ev)的T1态。一方面，几乎无处不在的氧分子可以通过光激发分子相互作用淬灭T1态，生成具有高反应活性的单重态氧(1O2)。 1O2和其他活性氧(ROS)与荧光团发生反应，破坏荧光团原有的结构，导致光漂白。另一方面，T1态的荧光团也可以与氧化还原活性或亲核物质反应，如分子氧、硫醇和氨基酸侧链，生成非荧光加合物。细胞通透性与荧光团的极性、大小和亲脂性有关。通过结构改造来提高性能，往往会导致三个方面的变化。因此，在将这些改进的荧光团用于细胞和体内成像之前，有必要对其细胞通透性进行评估。
优化有机荧光团性质的化学方法
红移有机荧光团的吸收和发射光谱
增大共轭π结构可显著红移荧光团的Abs/Emmax。主要有两种方法，1)延长共轭链，2)加入更多共轭π片段。在花青素骨架中，主链延长一个乙烯基片段可导致约100 nm的深色位移。经典三甲基菁菁(7,Cy3)的Abs/Emmax位于CH2Cl2的可见光区(590/626 nm)。五甲基菁菁(8,Cy5)比Cy3多含一个乙烯基，在CH2Cl2近红外区(689/ 725 nm)显示出Abs/Emmax。在此基础上，开发了波长较长的七甲基菁(9,Cy7)、、非甲基菁(10,Cy9)、和十一甲基菁(11,Cy11) (CH2Cl2中)。此外，在末端部分引入更多共轭苯也可以扩展分子内π体系，在荧光团的光谱中产生较大的色移。例如IR-1048(12)和Cy-PA(13)在1000 nm以上的吸收和发射最大值明显优于传统的Cy7。该策略可以扩展到其他荧光团(如罗丹明，香豆素和BODIPY)，并创造了许多长波长染料。
染料杂交也是实现光谱红移的有效方法。本质上，这种方法是基于共轭π结构的红移光谱放大。最经典的例子之一是在我们之前的工作中开发的半花青素染料(HD和CS染料)，是基于花青素与pyronin(或罗丹明或荧光素)的杂交而构建的。与亲本染料相比，HD和CS染料的Abs/Emmax均显著增加。此外，调节电子效应和扩大共轭π结构可以与该策略相结合，进一步实现染料光谱的红移。各染料的Abs/Emmax均为单乙胺<二乙胺(14)<朱柳胺(15)。此外，萘环的引入使Abs/Emmax红移了20 nm(16)。到目前为止，不同染料之间的杂化已经成为一种流行的延长染料波长的方法。此外，该方法还可以引入光调控和修饰位点，大大拓宽了染料在生物传感和生物成像方面的应用。
杂原子的引入也使荧光团光谱的红移成为可能。一般来说，用更少的供电子原子取代桥接氧，如14族元素(C、Si、Ge)、15族元素(P)和硫原(S、Se、Te)，可以使染料的Abs/Emmax红移至深红色，甚至近红外区域，[1a]这是由于杂原子σ*轨道和荧光团π*轨道之间的σ*-π*共轭作用稳定了LUMO能级。Drexhage等人将季碳引入pyronin罗丹明中，构建了第一个C-pyronin。荧光团显示605/627 nm的Abs/Emmax(17)。后来，Qian和他的同事设计了第一个Si-pyronin，并将Abs/Emmax提升到634/653 nm(18)。吡咯蛋白单元是罗丹明染料的发光结构，决定了其光学性质。因此，这些方法可以接枝到罗丹明染料中。c -罗丹明和si -罗丹明依次产生，其Abs/ Emmax比四甲基罗丹明更长。基于相同的机理，将硫原(S, Se, Te)掺入罗丹明中，生成一系列具有红移Abs/Emmax的异相罗丹明染料。此外，用更具吸电子性的取代基，如砜和膦酸盐取代桥接氧，可以激发罗丹明染料的abmax和Emmax到近红外区域。该策略已扩展到其他染料骨架(NBD，香豆素，半花青素)，产生一系列光谱红移荧光团。
提高有机荧光团的亮度
由于π -π堆叠相互作用，水溶性不足会引发荧光团的自聚集，从而导致消光系数和量子产率的降低。亲水性基团的掺入(离子取代基包括阴离子取代基(羧酸、磺酸、磷酸)、阳离子铵取代基，以及具有多极性基团的非离子取代基(聚乙二醇(PEG)、聚甘油(PG)树突、环糊精和树突状碳水化合物衍生物))可以显著增强染料的水溶性。因此，这些染料在生理环境中可以有效地增强其亮度。例如，含有多个阴离子和非离子取代基的七甲基菁染料比传统的Cy7具有更好的水溶性和更高的亮度(35,36)。最近，Chan等人将亲水葡萄糖部分引入azaBODIPY中，显著提高了azaBODIPY的水溶性(定义为水油分布系数LogD，其中39的水溶性(LogD =2.51±0.92)远低于40 (LogD =0.75±0.02)、41 (LogD = 1.12±0.16)和42 (LogD = 0.71±0.11)，消光系数和量子产率增大，消光系数和量子产率也随之提高。2020年，Smith及其同事设计了一个三维结构，并在35的中位芳基取代基上安装了两个亲水臂(peg)。这两条臂位于每条多烯之上，并准确地屏蔽了刚性疏水核心(七甲基胺骨架)(37)，减轻了染料/染料的自聚集，提高了消光系数。对屏蔽策略进行了改进，使36变为38，亮度更高，并应用于构建明亮的NIR II荧光团。然而，与单个染料的自聚集相比，荧光团在蛋白质表面或细胞器上的积累在蛋白质标记中更受关注，导致标记亮度和准确性降低。Schnermann等对这部分进行了系统的研究。将净电荷接近为零的荧光团与抗体偶联技术结合，可以缓解染料的自聚集和在蛋白质表面或细胞器上的非特异性吸附，提高标记亮度和特异性(43)。此外，他们还证实，用C4 ' - o -烷基取代C4 '苯酚可以提高花菁染料与硫醇的反应电阻率。平衡分子电荷的策略可以推广到其他染料骨架。最近，Gibbs和他的同事们设计了罗丹明染料，通过加入一个带负电荷的单一磺酸部分，并平衡了SiR-Me和TMR-Me中的阳离子。该策略同时赋予新型荧光团(orfluoror dye, 44,45)比传统的SiR和TMR具有更高的溶解度和亮度，同时保持良好的细胞膜通透性。值得注意的是，这种新型染料在响应环境电荷时表现出荧光惰性，并且抵抗与亚细胞结构的非特异性结合，这使得它们可以用于定量成像。除了亮度增强外，水溶性的延长还可以导致染料代谢途径的改变，这为探索代谢相关疾病和器官损伤。
对于其他含有外部给电子基团(二氨基基)的传统荧光团，包括罗丹明、香豆素、NBD、萘酰亚胺、吖啶、rhodol、恶嗪，低量子产率最合理的解释是在极性溶剂中形成TICT。 TICT的形成在没有光子发射的情况下松弛，伴随着激发态的非辐射衰减。最近的研究表明，TICT的形成主要由两个因素决定:1)位阻;2)电子效应。理论上，增大电子给体的空间电阻和减小电子给体的容量都可以增大转化为TICT态的能垒，从而抑制TICT的形成。2008年Holey等利用7-azabicyclo[2.2.1]庚烷取代二烷基胺，成功固化了氨基取代基，抑制了TICT的形成，大大提高了罗丹明染料的亮度。2015年，Lavis等人将罗丹明的二烷基胺替换为氮杂啶，使二烷基胺具有更高的旋转能势，抑制了TICT的形成，同时只导致了很小的结构变化。因此，改性可以提高罗丹明的亮度，而不会对其他光物理和生物特性产生实质性的有害影响。然后，他们将该策略扩展到其他荧光团，包括香豆素、萘酰亚胺、吖啶、rhodol、恶嗪和罗丹明衍生物，并构建了一系列明亮的荧光团。此外，Xu、Liu等用比氮杂啶结构更小的叠氮吡啶取代了荧光团的二烷基胺，再次验证了该方法在抑制TICT形成和提高荧光团亮度方面具有普遍性。
与通过环化烷基胺来增加空间阻力不同，Xiao、Liu、Yang等人通过在二烷基胺中引入吸电子的四元哌嗪来抑制TICT的形成。[12d]季哌嗪部分通过感应效应降低了相邻氨基的给电子强度，增大了TICT形成的能势，从而提高了罗丹明染料的亮度。然后，他们证明了该策略在其他荧光团(萘酰亚胺、NBD和BODIPY)中的普遍性。[12d,60] Guo等采用同样的策略，将具有强吸电子能力的砜加入罗丹明(48)和其他类型的荧光团(c -罗丹明、si -罗丹明、膦-罗丹明、嗪、香豆素、萘酰亚胺、BODIPY)中，实现了荧光团的亮度增强。Lavis等人利用二次同位素效应证明，用氘(D)(49)取代氢(H)原子可以降低烷基胺基的供电子能力，从而提高荧光团的量子产率。然而，上述方法在提高亮度的同时，也会导致吸收光谱和发射光谱的过色移，不利于染料的广泛应用。
染料的亮度也可以通过增加摩尔消光系数来提高，同时保持荧光量子产率的恒定或小波动。消光系数与荧光团的平面度有关，一般情况下，荧光团越平面，消光系数越大。2008年，Suzuki等报道了一种通过在BODIPY染料的π体系中加入杂芳基基团(呋喃)来增加荧光团平面度的方法，并实现了消光系数2-3倍的增强。此外，他们在含有共轭呋喃的染料类型中引入了不同的给电子基团，并在保持大消光系数的同时精确调节吸收和发射最大值。2019年，Chan及其同事通过将环己烷掺入azaBODIPY染料中，设计了几种对抗性限制性荧光团。]这些荧光团显示出比它们的母体染料更高的消光系数。同样，基于通过结构修饰产生更平面的荧光团的方法，已经开发出各种具有高摩尔消光系数的荧光团。
促进有机荧光团的稳定性
迄今为止，光漂白的机制尚未完全探索。漂白的主要途径之一涉及三重态，这已在第二部分详细说明。针对这一漂白途径，缓解荧光团光漂白的方法有三种:1)在荧光团结构的合适位置引入吸电子基团(EWGs);2)屏蔽易与1O2及其他ROS反应的部位;3)在荧光团中加入小分子三重态猝灭剂(TSQs)以缩短三重态寿命。
在合适的位置引入EWG可以降低电子密度，从而降低荧光团与1O2和其他ROS的反应性。以香豆素染料为例。Kuznetsova和Kaliya证明了7-二乙基氨基-4-甲基香豆素的富电子甲基可以以依赖光的方式氧化，并产生4-甲基碳中心自由基，该自由基进一步与氧反应生成过氧化物，最终生成醇、醛或羧酸。Jackson等人用吸电子的三氟甲基取代富电子甲基，显著提高香豆素的光稳定性。基于类似的方法，Sun及其同事在荧光素的2 '和7 '位置偶联了氟原子，并实现了比传统荧光素光稳定性提高两倍。随后，科学家将该策略扩展到花青素染料，并构建了一系列具有改进光稳定性的荧光团，例如，含有氟原子的70比69具有更好的光稳定性。
用大块的基团屏蔽位点可以增加空间位阻，降低荧光团与ROS和亲核试剂的反应性。Schnermann等证明了花青素的主要光漂白途径是与光敏化的1O2反应。O2可以攻击多甲基链，形成二氧乙烷加合物。加合物最终通过C - C裂解转化为羰基产物。此外，荧光团和亲核试剂之间的反应被认为是菁染料光漂白的替代途径。Cosa及其同事在他们的作品中详细讨论了这一过程。他们的研究结果表明，Cy染料可以通过光照射和系统间交叉(ISC)转变为三重态激发态。然后，三重态激发的Cy与溶液中的硫代酸酯反应，通过PeT过程和三重态-单线态系统间交叉生成自由基对。最后，这些新生的双生基对中的大多数将形成没有发射的cy -硫醇加合物(暗态)。然而，作者也发现，通过酸催化反应和光诱导的硫醇消除，暗态Cy-硫醇加合物可以部分地再生Cy，使Cy再次发光。利用这种光开关现象，可以用Cy染料实现单分子和超分辨率成像。值得注意的是，如果这些Cy染料被具有空间位阻效应的烷基锁定，它们的类似物就不能进行光电转换。这些结果表明，传统Cy染料的聚甲基链容易发生氧化断裂或亲核加成形成暗态，这可能是其光漂白的主要原因。一些研究表明，在罗丹明染料中也可以发生巯基的光开关现象，表明这可能是罗丹明光漂白的原因之一。
在溶液中加入小分子三态猝灭剂(TSQs)，如1,3,5,7 -环己四烯(COT)、4-硝基苄基醇(NBA)、Trolox和Ni2+，是提高荧光团光稳定性的另一有效途径。由于它们能够减少T1态的发生，这些猝灭剂可以减少1O2的产生，减轻荧光团的瞬态暗态，从而提高它们的光稳定性。然而，该方法通常需要非常高的浓度(mM)的tsq才能在溶液中没有分子氧的前提下提高光稳定性，这阻碍了其在活细胞成像中的应用。为了解决这个问题，这些tsq与荧光团的共价键被开发出来。
例如，Blanchard及其同事将TSQs引入Cy5(79-81)，并显著提高了其在脱氧溶液中的光稳定性。Chen及其同事设计的COT-Cy3和COT-Cy5具有较低的光毒性，并能实现可靠的长期成像。这种方法也被其他科学家推广到罗丹明、恶嗪染料，并产生了多个光稳定的荧光团。
大多数传统的荧光团在电子结构中表现出对称的HOMO和LUMO轨道的共同点，这使它们具有高量子产率，但导致振动亚轨道减弱。因此，电子不能从激发态相互转换到较低的振动态，导致发射最大值固定在激发最大值附近。因此，引入不对称电子结构增加HOMO和LUMO轨道的振动贡献是诱导内部转换，进而扩大Stokes位移的可行途径。最近，Yuan组和Xian组基于这一机制，分别将具有较强给电子能力的1,4-二甲基-十氢喹啉或四氢喹啉引入到rhodol或rhodamine染料中，赋予染料不对称的电子密度，并诱导HOMO轨道的不对称振动。本质上，该方法将罗丹明或rhodol的对称电子结构转化为具有ICT特征的染料，成功地将荧光团的Stokes位移放大了3倍，同时减小了HOMO和LUMO轨道的间隙，并使吸收和发射光谱发生了红移。他们进一步将该方法扩展到其他荧光团，包括rhodol、Sipyronin、oxazine、square acid和cyanine，产生了各种具有大Stokes位移和长波长的新型荧光团。[10c]然而，这种改性也导致了水溶液的亮度降低，限制了染料在先进成像技术中的应用。为了解决这一问题，Yuan等人进一步加入了具有不同电子推拉效应的取代基，并系统地调节了四氯喹诺啉部分的电子密度。随着取代基吸电子能力的提高，改性染料的亮度增加，斯托克斯位移减小。值得注意的是，在保持合适Stokes位移(56 nm)的前提下，YL578(96)与三氟乙基结合的荧光比RhB更亮(2倍)。他们将这种修饰扩展到红石，香豆素和BODIPY染料中，并构建了一类具有改进亮度和斯托克斯位移的荧光团(97,99,101)。此外，含有四氟喹诺啉基团的对称罗丹明(5)或含有杂原子的不对称罗丹明表现出延长的Stokes位移，可能是由于ICT效应的增加或振动弛豫。潜在的机制仍有待于未来的探索。
调节有机荧光团的细胞通透性
细胞膜是一种复杂的复合物，由含有多种脂质和膜蛋白的双层组成。细胞膜控制物质的摄取和排出，在维持细胞稳态中起着重要作用。荧光团或探针作为外源小分子，必须首先穿过细胞膜，才能实现对细胞内生物分子的标记和检测。因此，在荧光团和探针应用于细胞成像之前，需要评估细胞的通透性，这与标记或检测效率密切相关。大多数小分子荧光团和探针通过被动扩散进入细胞。极性、大小和亲脂性是影响特定化合物扩散效率和细胞渗透性的三个关键因素。利平斯基和他的同事们建立了“5法则”，这已经成为了小分子药物的细胞渗透性的最主要的框架。该规则假定当:1)分子量大于500时，小分子药物更可能具有渗透性差;2)有5个以上的氢键供体和10个以上的氢键受体;3)计算出的logD大于5。虽然该规律并不适用于所有的小分子，但它对预测渗透率具有重要的指导意义。
近年来，提高荧光分子的细胞通透性成为提高标记或检测效率的热门研究领域。小而不带电的荧光团通常具有良好的细胞渗透性。在传统的荧光团中，罗丹明和类罗丹明染料是特殊的，因为非荧光螺内酯和荧光两性离子之间存在可逆平衡。引入D50值(当一半荧光团分子以两性离子形式存在于二氧六烷和水的混合物中时的介电常数)和KL-Z值(平衡常数)来表征平衡。经典染料中两性离子态占主导地位，D50值小(<30)或KL-Z值大(LogKL-Z >0)的罗丹明染料。通过结构修饰将D50值提高到40-80或将LogKL-Z值降低到3 - 2，通常会使罗丹明荧光团具有较好的细胞渗透性。实现这一目标的方法主要有三种。第一种方法是降低杂蒽部分的电子密度，使9位碳更容易受到亲核羧基部分的影响，从而形成罗丹明染料的闭环。该方法包括用较弱的供电子原子(如碳、硅、硫)取代桥接氧原子，在R1、R2位点偶联吸电子部分(如氟、CF3CH2)，并引入氟取代的氮杂化取代二烷基胺部分。第二种方法是将羧基转化为酰胺，由Johnsson及其同事开发。他们的发现表明，电子缺陷酰胺(如酰基氰酰胺、酰基磺胺、酰基磺胺、烷基氟烷、烷基酸和系列衍生取代基)可以有效地用于微调罗丹明染料的平衡，并增强其螺环化。第三种方法是利用邻族效应。位于邻位的酰胺或氨基可以与罗丹明染料相邻的羧基形成分子内氢键，从而稳定螺内酯状态。与亲本染料相比，经该方法修饰的染料D50值较大或LogKL-Z值较小，具有较好的细胞渗透性，在超分辨成像中具有较高的标记效率和成像质量。
然而，含有强吸电子桥接部分的荧光团(如砜和膦酸盐)可能面临过度倾向于疏水和非荧光的螺旋内酯状态的问题，这导致在用于细胞成像或蛋白质标记时荧光弱。Lavis等将氟原子共轭在悬置苯上，阻碍了螺环化反应，平衡了罗丹明的两种状态，在一定程度上缓解了上述问题。更常见的是，引入具有强极性的局部电荷，如羧酸、磺酸和磷酸、季铵，可以增加荧光团的溶解度，改善光物理性质，但牺牲细胞的渗透性。这些极性取代基的酯化或酰胺化是掩盖电荷影响的有效方法。例如，得益于内源性细胞酯酶的水解，生物不稳定的保护基团，如乙酰氧基甲基(AM)已被广泛应用于将这些含有酸或羟基取代基的荧光团递送到细胞中。例如，米勒和他的同事开发出了比传统荧光素具有更高水溶性的荧光素。然而，由于在生理条件下存在两个负电荷，它表现出较差的细胞渗透性。在分子内引入多个AM片段使其能够快速进入细胞。同时，酯酶裂解释放的荧光素可以留在细胞内，实现细胞的长期成像。Yuan等通过氨基乙酰化和羧基酯化有效调节不对称罗丹明染料的细胞通透性，并开发了一系列更容易被癌细胞吸收的荧光团 。与细胞内成像不同，细胞外或细胞膜成像需要难以穿过细胞膜的荧光团。上述含有局部电荷的荧光团能够满足这些要求。此外，含有长烷基链的荧光团或探针可以插入细胞膜的磷脂双分子层，进一步使共轭荧光团照亮细胞膜。
改进的有机荧光团在成像和传感中的应用
高信噪比的深部组织成像
基于光致发光(PL)的生物医学成像为生物过程动态的无创实时可视化提供了一种可行的方法。但传统荧光团由于激发和发射波长短(< 900 nm)，穿透深度严重不足，导致深部组织成像信噪比较低。近年来，科学家们通过将光谱红移至近红外II区(900-1700 nm)，并通过结构修饰提高亮度、水溶性和光稳定性，显著提高了荧光成像的穿透深度，成功实现了生物体内深部病变或高信噪比生理过程的可视化。
2015年，Dai、Cheng、Hong等人基于D-A-D染料开发了一种NIR II荧光分子CH1055。为了提高水溶性，他们将多个peg掺入CH1055中。CH1055-PEG在1055 nm处显示出最大发射，水溶性好，通过肾脏排泄的代谢效率高(24小时内通过肾脏清除90%)。使用该分子，他们实现了小鼠淋巴血管和血液的成像，淋巴结成像的分辨率高于ICG。得益于良好的被动肿瘤摄取，该分子也可用于完整小鼠头皮和颅骨的非侵入性脑肿瘤鉴定(深度约为4mm)。此外，他们证实了NIR II成像比NIR I成像具有更高的肿瘤与正常组织之比(5倍)，并进一步将荧光团及其衍生物应用于精确的图像引导肿瘤切除手术。随后，他们将磺酸基掺入CH1055中，生成水溶性近红外II荧光团CH-4T。CH-4T与血浆蛋白结合，进一步提高亮度。
这些组件能够以超高的时间分辨率对旋转的心脏周期进行动态成像。Zhang等在蓝蛋白骨架的基础上，构建了具有近红外激发和发射特征(1064/1080 nm)的近红外染料FD-1080。与波长较短的激发染料(<980 nm)相比，该染料具有优势的穿透深度和成像分辨率。FD-1080还可以通过呼吸颅足运动的动态成像对呼吸频率进行量化分析。在染料的基础上，他们通过增加共轭体系进一步设计了荧光团LZ1105。]荧光团具有较长的血液循环时间，可用于监测血管的动态过程，包括溶栓、缺血再灌注、血脑屏障(BBB)的打开和恢复。
Sletten及其同事开发了近红外II型荧光团PhosphoChem7。该荧光团表现出优异的水溶性，受益于四个磷酸官能团的掺入。值得注意的是，这些功能作为钙离子结合模块，也使荧光团在清醒和运动小鼠中具有骨成像能力。此外，其他花青素样或D-A-D型近红外对比剂，以及具有近红外发射能力的改性BODIPY和罗丹明染料也已在体内应用于高质量的单色近红外成像。
蛋白质标记
蛋白质几乎参与了细胞中所有的生物活动。为了揭示蛋白质在活细胞中的行为和功能，包括定位、迁移、相互作用和构型变化，科学家们开发了许多分析方法。在这些方法中，蛋白质标签(基因编码标签、天然蛋白质配体、双正交反应中的非天然氨基酸)巧妙地将特定的天然蛋白质或标签蛋白质或人工支架修饰的蛋白质与通用荧光团结合在一起，从而简化了实验操作并增加了标记灵活性。常见的标签有CLIP-tag、SNAP-tag、Halo-tag、TMP-tag等基因编码标签，其他与天然蛋白具有高亲和力和特异性的配体，如靶向F-actin的jasplakinolide，靶向微管的docetaxel，以及非天然氨基酸，如tetrazine。将荧光团与这些蛋白质标签或配体结合形成荧光标记，可以特异性地识别标签蛋白质。值得注意的是，这种方法需要明亮、光稳定和可渗透的荧光团来获得理想的标记结果。到目前为止，基于改进的有机荧光团已经开发出多种荧光标记，并广泛应用于蛋白质相关的研究。
以改进的罗丹明染料为例。2013年，Johnsson等合成了Si-rhodamine (SiR)，并基于SiR开发了一系列远红蛋白标签(SiR- snap、SiR- clip、SiR- halo、SiR-tetrazine。其中，SiR-SNAP被用于大鼠脑的离体标记，而SiR-tetrazine能够对活的大肠杆菌细胞中遗传编码的一种非天然氨基酸(UAAs)进行位点特异性标记。最近，SiRHalo被用于定量兴奋性突触中内源性突触蛋白PSD95的寿命。通过将吲哚啉引入SiR中，他们还开发出了近红外激发和发射最大(690/715 nm)的SiR700，并构建了一系列近红外蛋白标记(SiR700-actin、SiR700- snap、SiR700-tubulin和SiR700-溶酶体)。通过这些基于SiR和SiR700的标记，他们能够同时标记和成像(共聚焦显微镜和STED显微镜)两种蛋白质，并为研究蛋白质-蛋白质相互作用提供了新的工具。此外，Hell等在Stokes大位移荧光团的基础上，开发了多种Stokes大位移荧光标记，实现了活的人成纤维细胞和活的大鼠海马神经元中神经束蛋白、线粒体、肌动蛋白和微管蛋白的四色成像。Lavis及其同事扩展了一种基于含有氮杂啶的JF染料的明亮标签。与基于传统染料的标签相比，JF标签的信噪比明显更高。JF635-Halo被用于标记果蝇幼虫活脑组织中的Halo-tag蛋白。Yuan、Wang等人基于亮度高、光稳定性好、Stokes位移大的荧光团，设计了YL578-Halo荧光标签。与基于传统染料的标记相比，该标记具有更好的亮度和光稳定性，并且可以对线粒体输入受体蛋白Tomm20进行3D STED成像。为了进一步减少非特异性靶向引起的荧光背景，提高信噪比，Johnsson, Wang等人开发了新的蛋白质标签。(MaPs)具有良好的细胞通透性和蛋白标记后的荧光增强，，这在之前的综述中已经进行了全面的总结。最近，Johnsson, Hiblot等人将分子对接与筛选相结合，开发了可交换的结合Halo-tag的配体，并构建了可可逆标记的荧光标记。与共价halo标签相比，这些标签的光稳定性显著提高，延长了标记蛋白在STED成像中的可视化时间。
生物传感
活性小分子和酶的检测
近年来，由于其优异的光学性质、易于合成和荧光可调等优点，紫蛋白和荧光蛋白/pyronin的杂交产物荧光团hd被广泛应用于设计活化的近红外荧光探针，用于检测不同疾病相关的生物标志物，包括ROS、RNS、RSS和酶。最近的一篇综述系统地总结了基于hdd的探针的设计和应用。此外，Yuan等在化学稳定的荧光团(CS染料)的基础上，构建了一系列可激活探针，检测亮氨酸氨基肽酶(LAP)、硝基还原酶(NTR)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)、过氧亚硝酸盐(ONOO)、超氧阴离子(O2 )等多种疾病相关生物标志物，实现了对药物性肝/肾损伤的高保真评价和特异性肿瘤成像。为了扩展成像深度和信噪比，他们通过扩大共轭体系和引入强给电子基团，设计了具有光学可调羟基部分的系列NIRII染料(niri - hd)。他们利用niriihd合成了三种活化的NIRII探针(NIRII-HD5-ONOO、NIRII-HD5-GSH和NIRII-HD5-ALP)，用于检测ONOO、GSH和碱性磷酸酶(ALP)。其中，NIRII-HD5-ONOO可用于lps诱导的淋巴炎症和转移性肿瘤诱导的前哨淋巴结的体内成像。此外，用硫原子代替HDs中的桥接氧原子可以在红移光谱的同时平衡染料的荧光和光声成像性能，提高探针在光声成像中的灵敏度。 Chan和同事以及Chen、Shen和同事独立构建了几个可激活探针，以染料(s - hd)作为荧光团，用于监测疾病的体内生物标志物(β-半乳糖苷酶、NTR和H2O2。PA- hd -H2O2和AS-Cy-NO2分别成功用于阿尔茨海默病小鼠和肿瘤中生物标志物的高质量PA检测。上述探针在检测疾病相关生物标志物方面具有优异的性能。然而，这些探针很难检测到特定器官(如肾脏)中的生物标志物。水溶性部分与荧光染料的掺入不仅可以防止染料的自聚集，提高染料在水溶液中的荧光亮度，还可以改变其代谢途径，使染料通过肾脏排出体外，使其具有靶向肾脏成像的能力。这些类型的共轭分子通常以肾脏清除光学剂(RCOAs)命名。常见的水溶性成分包括菊粉、葡精、环糊精、葡聚糖、聚乙烯吡罗烷酮(PVP)和聚乙二醇(PEG)。朴和他的同事在这部分进行了象征性的工作。2019年，他们将高水溶性(2-羟丙基)-β-环糊精(hp -β cd)与hd偶联，合成了肾清除荧光团(CCD)。然后，他们构建了三个可激活探针(MRPs)，分别检测O2、NAG和caspase-3。应用MRPs，他们实现了药物性急性肾损伤的早期诊断。最近，Huang及其同事设计了几种新型rcoa，并成功监测和评估了早期急性肾功能衰竭。Pu group在2021年发表的一篇综述中对rcoa的设计和应用进行了更详细的研究总结。
气体信号分子的检测
包括一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)、硫化氢(H2S)在内的气体信号分子参与生物体内多种信号通路，在信号转导和疾病发生发展中发挥重要作用。荧光探针是检测这些信号分子波动的有效工具，已广泛应用于揭示其生理和病理功能。值得注意的是，改进的荧光团为设计探测气体信号分子的探针提供了新的途径。例如，在荧光团的中心位置引入氨基通常会导致低色差，而增加斯托克斯位移。通过结构修饰或化学反应屏蔽氨基可以逆转这一现象。2021年，Chan等将对甲氧基苯胺掺入IR-26、IR-1061、IR-1048、Et-1080和Flav7中，合成了几种吸收时间短的探针。[118]这些探针可以与NO反应，转化为n -亚硝基产物，其吸收波长显示在近红外II区。使用探针APNO-1080，他们实现了深部组织原位乳腺癌成像。同样，Guo等人基于Stokes位移大的杂蒽染料，开发了两种检测Hg2+和NO的探针，并原位跟踪阿尔茨海默氏小鼠脑内NO波动。
监测微环境变化
蛋白质、细胞器和器官需要适当的微环境来维持其生理功能。微环境稳态的破坏可能导致催化活性降低或功能障碍，进一步导致紊乱和疾病发展。因此，监测这些变化，包括pH、温度、极性、粘度、缺氧、膜电位和膜张力，对于了解微环境相关的生理病理至关重要。各种荧光探针被设计用于监测微环境的变化。以用于监测膜电位的探针为例，膜电位是每个细胞中独特的生物物理性质。Miller和他的同事基于改进的罗丹明和荧光素染料开发了一系列荧光指示剂(VoltageFluors)。亲脂性和富含电子的分子线与荧光团融合，使这些指示剂定位到膜上，并通过光诱导电子转移(PeT)过程淬灭染料的荧光。膜电压信号可引起去极化，并解除PeT过程，导致荧光改善。电压荧光染料检测电压变化依赖于电子的运动，电子必须在荧光之前拦截激发态发色团。Miller及其同事在2020年发表的一篇综述中详细总结了指标类型的设计和应用。2021年，他们进一步创新地将金属丝与水溶性优于3-羧基荧光素的磷酸荧光素偶联，实现了对膜电压的优异检测。
总结
对微观分子机制和宏观病理的探索，促成了许多先进的荧光成像技术的出现。然而，传统的荧光团存在吸收和发射波长短、亮度低、稳定性差、斯托克斯位移小或渗透率不合适等性能不足，难以充分利用这些技术，阻碍了科学发现的进程。近年来，科学家们提出了一些可用的方法来改善荧光团(罗丹明、红石、BODIPY、花青碱、半花青碱等)的这些特性。这些改性染料大大提高了荧光成像的质量，使我们能够更清楚地观察分子结构和生物过程，并在早期了解疾病的发展。然而，改进的荧光团的性能仍然存在问题，其临床应用是有限的。
参考文献
Chemical Approaches to Optimize the Properties of Organic Fluorophores for Imaging and Sensing Gangwei Jiang, Han Liu, Hong Liu, Guoliang Ke, Tian-Bing Ren,* Bin Xiong,* Xiao-Bing Zhang, and Lin Yuan*，Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202315217， doi.org/10.1002/anie.202315217
