内容摘要
我们首次提出了“电子库-泵集成”的分子设计策略，即巧妙地将“电子库”和“电子泵”融合于一种合适的染料中，这极大地促进了I型PS分子的创建（通过密度泛函理论和光谱实验验证了空间电子流的操控）。在此基础上，我们构建了一系列有机小分子I型PSs，其中突出的I型PSCy5-NF在660纳米激光照射下能够特异性地大量生成O2−。Cy5-NF在光照下能够有效破坏细胞膜，并进一步导致肿瘤细胞发生细胞焦亡，这不仅消融了原发/远处肿瘤，还通过增强CD4+和CD8+T细胞浸润介导的长期免疫记忆，阻止了肿瘤向不同器官的转移。
设计与合成
首次提出的“电子库-电子泵集成”分子设计策略是将“电子库”和“电子泵”融合在一个合适的染料分子中，从而实现新型I型光敏剂的设计。根据这一策略，我们可以得出结论，构建这种I型光敏剂需要三个关键部分，包括一个合适的染料分子、一个“电子库”基团和一个“电子泵”基团。基于重原子的光敏剂通常具有不可忽视的暗毒性，并会缩短三线态寿命（从T1-S0)），这不利于高性能光敏剂的构建。因此，我们尝试利用不含重原子的分子作为合适的染料分子母体结构。我们选择了Cy5-Pr进行后续的结构改造。为了引入富电子基团，我们选择了两个磺酸基团作为“电子库”，从而得到了Cy5。随后，为了引入吸电子基团（作为“电子泵”），在Cy5的中间位置引入了吡啶结构（包括不同的吡啶盐），分别得到了Cy5-N、Cy5-NMe和Cy5-NF。同时，我们选取了Cy5-NF0（不含磺酸基团，即电子库）作为对照试剂。
关于O2•−Generation的机制解释
我们首先测试了Cy5衍生物的光谱。如图所示，新修饰的衍生物表现出与Cy5相似的光谱特性，这表明在Cy5中间位置修饰不同的空间位阻吸电子基团并未影响Cy5骨架的基本光物理性质。随后，我们测试了Cy5、Cy5-N、Cy5-NMe和Cy5-NF的荧光量子产率QY)。结果发现，随着中间基团吸电子能力的增强，荧光团的量子产率(QY)逐渐降低。此外，与Cy5-NMe相比，引入二三氟甲基苯基的Cy5-NF的量子产率QY略有提高。这种优越性能可能归因于引入了较大的空间位阻基团，从而限制了中间基团的整体旋转。重要的是，人们注意到，包括吡啶和吡啶盐在内的吸电子基团的修饰，使得这些衍生物的荧光强度相较于Cy5有所降低，这表明Cy5-N、Cy5-NMe和Cy5-NF中可能存在基于光诱导电子转移（PET）的荧光抑制现象。
我们随后进行了理论计算（基于密度泛函理论）。通过计算化学可以初步定性预测PET状态（S1态内部的变化，不同于T1−S0）形成的概率。由于Cy5中间没有吸电子基团，Cy5的δE（2.060672eV）远大于0.6eV，表明显然没有PET过程。对于含吡啶（包括吡啶盐）取代基的Cy5衍生物，随着取代基吸电子能力的增强，与Cy5相比，染料的δE值呈下降趋势，这与QY的变化趋势一致。Cy5-NMe和Cy5-NF的δE值与Cy5和Cy5-N相比接近0.6eV，表明这些分子（Cy5-NMe和Cy5-NF）中可能存在PET过程。注意的是，我们发现Cy5-NMe的δE值略小于Cy5-NF，这表明Cy5-NMe的PET抑制效应高于Cy5-NF。
为了进一步探究电子库-泵集成策略引发的电子流的作用（即研究该策略是否有助于O2−generation)），对上述化合物的活性氧（ROS）生成能力进行了详细测试。随着中间基团的吸电子能力逐渐增强，活性氧的生成能力也随之增强，这与上述计算结果一致，表明Cy5-NF是最佳的活性氧生成剂。值得注意的是，Cy5-NF的ROS（不是1O2)生成能力）明显高于Cy5-NMe，这归因于强吸电子基团（作为“增强型电子泵”）的引入有效地促进了电子流动，这与上述计算结果一致。实验结果表明，与Cy5-NF相比，Cy5-NF0产生的O2−(9.42-fold);显著减少，但1O2的生成量却大幅增加（53.57倍），这表明磺酸基团对于O2−的生成至关重要，尽管磺酸基团并未与Cy5骨架共轭。综合上述结果，我们可以得出结论：在Cy5-NF光激发后，来自磺酸基团（“电子库”）的电子被转移到与Cy5发色团相连的强吸电子吡啶盐基团（“电子泵”），然后这些电子进一步转移到O2形成O2−，这表明通过操控空间电子流构建了新型I型光敏剂。
为了进一步验证这一策略，设计了参考化合物Bodipy-COOMe和Bodipy-COO，随后测试了它们在光照下的活性氧生成能力。实验表明Bodipy-COO的电子储存库-泵集成结构能够有效促进电子转移，充分验证了“电子储存库-泵集成”的设计策略。同时，我们注意到Bodipy-COO的O2−producing能力总体上仍然较弱，这可能是由于Bodipy结构（“电子泵”）的吸电子能力不够强，这让我们对“增强型电子泵”基团的效果有了新的认识。总之，通过“电子库-泵集成”的设计策略，我们不仅成功构建了一系列的光敏剂，还通过引入不同强度的“电子库”和“电子泵”基团来操控空间电子流，最终制备出了新型I型光敏剂Cy5-NF（一种高性能的I型光敏剂），这对未来I型光敏剂的系统构建具有重要的启示意义。
Cy5-NF在细胞中的治疗特性
鉴于Cy5-NF具有出色的O2•−production能力，我们利用Cy5-NF进行恶性肿瘤治疗（在活细胞和体内）。在进行相关实验之前，我们首先测试了Cy5-NF的光稳定性和暗细胞毒。Cy5-NF在光动力治疗过程中能够保持稳定。此外，根据暗态下的细胞毒性结果，Cy5-NF在溶解状态下具有相当低的暗毒性。
由于Cy5-NF具有两个磺酸基团，难以穿过带负电荷的细胞膜，因此仅附着在肿瘤细胞的外膜上。经Cy5-NF处理并用660纳米激光照射的细胞显示出明显的来自碘化丙啶（PI）的红色荧光，这证实了Cy5-NF介导的光动力疗法能够杀死肿瘤细胞。我们分别在常氧（21%O2)）和低氧（1%O2)）条件下进行了Cy5-NF介导的光动力疗法实验。发现即使在1%O₂的条件下，I型光敏剂Cy5-NF介导的光动力疗法也不受限制，进一步证实了I型光敏剂在低氧条件下的有效性。
鉴于Cy5-NF难以穿过细胞膜，我们推测Cy5-NF介导的光动力疗法（PDT）可能会严重破坏细胞膜，从而有效杀死肿瘤细胞。据文献报道，当细胞膜被破坏时，肿瘤细胞可能会经历细胞焦亡过程。因此，我们研究了Cy5-NF介导的光动力疗法是否通过细胞焦亡来杀死肿瘤细胞。众所周知，细胞凋亡和细胞焦亡的细胞形态明显不同，这有利于通过形态学初步判断细胞死亡模式。在此基础上，我们观察了Cy5-NF介导的光动力疗法处理后的肿瘤细胞形态，此外，还进行了Cy5-NF孵育细胞实验（未进行激光照射，作为对照实验）。令人惊讶的是，经660纳米激光照射的Cy5-NF处理细胞在细胞膜上出现了明显的气泡，这是细胞焦亡过程的典型特征，与未进行激光照射的Cy5-NF处理细胞明显不同。为了进一步验证，我们进行了免疫荧光染色实验，以检测Cy5-NF介导的光动力治疗（PDT）后半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（一种细胞焦亡的特异性标志物）的表达情况。正如预期的那样，与空白组、空白+激光组以及仅Cy5-NF组相比，Cy5-NF+激光组的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1通道强度显著增强，这表明在Cy5-NF介导的光动力治疗过程中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1的表达上调。此外，根据细胞焦亡的另一个标志物GSDMD的免疫荧光染色结果，Cy5-NF介导的光动力治疗能够有效上调GSDMD的表达。
Cy5-NF在体内的治疗特性
在进行相关体内实验之前，我们评估了Cy5-NF的生物安全性。结果表明，与注射PBS相比，静脉注射Cy5-NF并未显著改变血液生化指标，H&E染色也未显示器官损伤，这表明其在实验小鼠体内具有良好的生物相容性且无明显生物毒性。此外，静脉注射Cy5-NF后，小鼠体重保持稳定，与注射PBS后小鼠体重变化趋势一致。这些结果表明，静脉注射Cy5-NF并未影响这些小鼠的良好身体状况，进一步证实了Cy5-NF的良好生物相容性。
光动力疗法（PDT）本身具有空间分辨率；也就是说，无论光敏剂是通过静脉注射还是瘤内注射给药，活性氧（ROS）只会生成于照射的肿瘤区域。我们选择在原发肿瘤内原位注射Cy5-NF（而非远处肿瘤），以确认治疗效果，随后对原发肿瘤进行660纳米激光照射。从肿瘤植入到治疗结束期间，每隔一天监测体重和肿瘤生长情况，以评估治疗效果。令人欣喜的是，肿瘤生长曲线和分离肿瘤的大小表明，与空白组、空白+激光组以及仅Cy5-NF组相比，Cy5-NF+激光组的原发肿瘤和远处肿瘤均得到了有效抑制。上述结果表明，Cy5-NF介导的光动力疗法在体内取得了良好的治疗效果。根据远处肿瘤的治疗效果，我们合理推测Cy5-NF介导的光动力疗法会启动肿瘤免疫治疗，从而有效抑制肿瘤转移。值得注意的是，我们在光疗后对肿瘤组织进行了形态学分析（H&E染色），结果显示，Cy5-NF介导的光动力疗法对原发肿瘤组织和远处肿瘤组织均造成了显著的破坏性损伤（检测到多个坏死部位），而其他组则未检测到明显的肿瘤损伤。此外，Cy5-NF+激光组在肿瘤治疗后的体重曲线保持稳定，而其他组则缓慢下降，这表明Cy5-NF介导的光动力疗法对肿瘤治疗具有显著益处。
随后，为了进一步确认Cy5-NF介导的光动力疗法是否能在体内诱导肿瘤发生细胞焦亡和免疫治疗效果，我们进行了更系统的免疫荧光染色实验。首先，我们通过2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）染色验证了接受Cy5-NF介导的光动力疗法的肿瘤中活性氧（ROS）水平的变化。结果表明，在原发肿瘤部位，Cy5-NF+激光组的活性氧生成（来自DCFH-DA通道的绿色荧光）明显高于其他组。更重要的是，在远处肿瘤部位，我们也观察到Cy5-NF+激光组的绿色荧光（DCFH-DA通道）显著增强，这可能与免疫治疗引起的氧化应激有关。此外，与对照组相比，Cy5-NF介导的光动力疗法不仅能有效上调原发肿瘤中caspase-1的表达，还能上调远处肿瘤中caspase-1的表达，这表明在Cy5-NF介导的光动力疗法过程中肿瘤组织发生了细胞焦亡。再次，原发肿瘤中谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）或4-羟基壬烯醛（4-HNE）阳性细胞几乎未变，进一步表明在Cy5-NF介导的光动力治疗过程中不存在铁死亡。更令人鼓舞的是，根据CD4+和CD8+T免疫细胞的染色结果，与其它组相比，Cy5-NF介导的光动力治疗能够有效上调原发肿瘤和远处肿瘤中CD4+和CD8+T细胞的比例，这证实了在Cy5-NF介导的光动力治疗过程中免疫治疗的激活。
结论
我们基于“电子库-泵集成”的分子设计策略，成功构建了高性能的I型PS，Cy5-NF。值得注意的是，实验结果表明，在没有磺酸基团（电子库）的情况下，Cy5-NF0只能在660纳米激光照射下产生1O2。此外，在移除强吸电子基团（削弱电子泵）后，Cy5-NMe的形成明显减少，这充分验证了上述策略。更重要的是，实验结果表明，Cy5-NF不仅具有出色的生物相容性，还能附着在肿瘤细胞的外膜上。因此，在660纳米激光照射下（甚至1分钟），Cy5-NF介导的光动力疗法能够特异性破坏细胞膜，从而诱导肿瘤细胞发生细胞焦亡（GSDMD和caspase-1上调）并启动免疫治疗（提高肿瘤内CD4+和CD8+T细胞的比例）。
参考文献
Controlled Electron Transfer: Implementing a Reservoir-Pump Integrated Strategy to Develop a TypeI Photosensitizer for Evoking Long-Term Tumor Immunological Memory, Li Xu, Haifeng Ge, Fang Zhu, Mingri Zhao, Hongwen Liu,*Xiao-Bing Zhang,* Zhe Li, J.Am.Chem.Soc.2025,147,35843−35857. https://doi.org/10.1021/jacs.5c12631
