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内容提要

   本工作开发了一种内质网靶向近红外II型光敏剂（TI-ER），它具有I型ROS生成和光热功能。TI-ER NPs被配制成纳米颗粒（NPs）后，能有效地被癌细胞内化，并在635 nm激光照射下诱导热休克，从而有效消融癌细胞和多细胞肿瘤球。

结果与讨论

探针的合成和光物理性质研究

   作为分子转子的 N,N'-二甲基取代的 TPE 分子是通过麦克马里偶联反应合成的。随后，分别通过铃木交叉偶联和克诺文纳格尔缩合引入了π桥和电子吸收基团。利用紫外可见吸收光谱和发射光谱研究了 TI-ER 的光物理特性。TI-ER 在 DMSO 溶液中的最长吸收峰位于 565 nm处。可见范围的吸收曲线来自于 N,N'-二甲基取代的 TPE 单元和吲哚分子之间的分子内电荷转移（ICT）转变。TI-ER 的 AIE 效应是在二甲基亚砜/水二元溶剂体系（水的体积分数 (f_w) 变化）中进行评估的。TI-ER 在二甲基亚砜溶液中表现出微弱的发射，以吲哚菁绿（ICG）为参照物，其荧光量子产率（Φ_f）低得难以察觉。然而，当 f_w 超过 50%时，其荧光强度会增加，在 f_w 为 80% 时达到最大值，在 1075 nm 处达到发射峰值。动态光散射（DLS）分析进一步揭示了 TI-ER 纳米团聚体在 f_w 值为 99% 时的形成情况，其平均流体力学半径为 66 nm，Φ_f 为 0.018%。此外，TI-ER 在吸收和发射光谱中表现出的溶剂依赖性变化可以忽略不计。使用 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，一种商用 ROS 指示剂）研究了 TI-ER 产生的 ROS。用 635 nm激光照射后，DCF 的荧光强度迅速增加，15 s后趋于平稳，这一信号明显超过了水晶紫（CV）和氯霉素 e6（Ce6）的对照值。为了确定产生的 ROS 的具体类型，使用了单线态氧（O₂）指示剂 ABDA、羟自由基（-OH）指示剂 HPF 和超氧阴离子自由基（O₂^•-）指示剂 DHR 123。在相同条件下，TI-ER 能有效地产生 I 型 ROS，包括 O₂^•-和 -OH，而不产生O₂。除了能产生强效的 ROS 外，TI-ER 还具有光热特性，光热转换效率（η）达 34%。更重要的是，TI-ER 在六个激光开/关周期内都能保持稳定的温度升高，这证实了 TI-ER 极佳的光热稳定性。

   为提高溶解度和稳定性，采用标准纳米沉淀法制备了 TI-ER NPs。该 NPs 的封装效率为 88.9%，药物装载量为 25.6%。经测量，其水动力半径为 99 nm，扫描电子显微镜成像进一步证实了这一点。对 TI-ER NPs 的光物理特性进行了全面评估。TI-ER NPs 的最长吸收波长和发射波长分别位于 564 nm和 1075 nm，Φ_f 为 0.021%。同时，TI-ER NPs 在 H₂O 和 PBS 中 72 h内都保持了极好的稳定性。用 635 nm激光照射含有 TI-ER NPs 和 DCFH-DA 的溶液时，DCF 在 530 nm波长处的荧光增强了 886 倍，这表明 TI-ER NPs 能产生大量 ROS。激光辐照导致 ABDA 吸收曲线和单线态氧传感器绿（SOSG）发射曲线的变化微乎其微，甚至辐照时间延长到 180 s也是如此，表明没有生成 O₂。在激光照射下，用 HPF 取代 ABDA 产生的荧光变化极小。相反，在相同条件下，532 nm波长处 DHR 123 的荧光强度增加了 345 倍。

   除了 ROS 生成能力之外，还评估了 TI-ER NPs 的光热特性。激光照射会使含有 TI-ER NPs 的水溶液温度显著升高，升温幅度与 NPs 浓度和激光功率密度成正相关。当 TI-ER NPs 浓度达到 500 μM 时，照射 TI-ER NPs 溶液（635 nm，0.75 W cm-2，20 分钟）会导致溶液温度升高，相应的温度升高 (ΔT) 为 35.3 ℃（从 26.5 ℃ 升至 61.8 ℃）。提高激光功率密度同样会产生大量加热，使 ΔT 高达 55.9 °C。重要的是，与 ICG 相比，TI-ER NPs 表现出更好的光热稳定性，在六个连续的加热-冷却循环中保持了一致的 ΔT 值。此外，TI-ER NPs 的 η 被测定为 49%。

体外实验研究

   利用流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对TI-ER NPs的细胞染色性能进行了全面评估。流式细胞术实验表明，TI-ER NPs 可在 1 小时内被有效内化，将培养时间延长至 3 小时可显著增强荧光强度。将孵育时间进一步延长至 12 小时后，NPs 的内化效果仅略有改善，这表明 3 小时是最佳染色时间。随后进行了亚细胞定位研究。使用ER-Tracker Green（ETG）、MitoTracker Green（MTG）、BODIPY 493/503和Hoechst 33342等商业探针进行共定位实验发现，TI-ER NPs的荧光信号与ETG的荧光信号有较好的重叠，皮尔逊相关系数（PCC）为0.73，表明TI-ER NPs具有特异的ER靶向能力。这种精确的ER靶向能力促使我们评估TI-ER NPs在细胞内产生ROS的情况。用 TI-ER NPs 和 DCFH-DA 对预先染色的细胞进行激光照射（635 nm，0.75 w cm^-2，5 分钟）会产生明亮的绿色荧光，而未照射的细胞则显示微弱的荧光。使用二氢乙啶（DHE）、HPF 和 SOSG 进行的其他实验证实，光敏 TI-ER NPs 主要在活细胞中产生 O₂^•-。

   在对4T1细胞进行TI-ER纳米颗粒（NPs）处理并进行激光照射（635 nm，0.75 W cm^‒2，10分钟）后，观察到细胞肿胀伴随质膜起泡现象。当激光功率密度提高至1 W cm^‒2时，这些效应明显增强。泡状突起源自细胞膜，与焦亡的形态特征高度一致。为了验证TI-ER NPs诱导的焦亡，进行了Western blot分析。4T1细胞在与TI-ER NPs孵育并暴露于635 nm激光后，全长Gasdermin（GSDMD）和Caspase-1的表达水平显著下降。相比之下，其他对照组（空白组、空白组激光照射以及TI-ER NPs组）这些蛋白质的表达变化可忽略不计。结果清楚地表明，TI-ER NPs介导的光疗法触发了Caspase-1的裂解，从而促进了GSDMD的酶解。释放的GSDMD-N片段能够在质膜中形成孔道，导致细胞内容物泄漏，从而诱导焦亡。随后进行的Annexin V-FITC/PI染色提示TI-ER NPs介导的光疗法过程中同时诱导了细胞凋亡。通过MTT法定量评估了TI-ER NPs对4T1细胞的光治疗效果。在未进行激光照射的情况下，TI-ER NPs对4T1细胞表现出可忽略的细胞毒性。然而，进行激光照射后，其呈现明显的浓度依赖性细胞毒性，IC₅₀值为34.58 μM。使用Calcein AM/PI进行的活/死细胞染色及流式细胞术分析表明，TI-ER NPs的光疗法对4T1细胞具有强效细胞毒性。

MCTS 模型研究

   MCTS 模型是一种模拟缺氧肿瘤微环境的传统三维（3D）培养系统，用于评估 TI-ER NPs 的疗效。采用悬滴法生成直径约为 1000 μm 的 4T1 MCTS。用 TI-ER NPs（50 μM）培养 3 小时后，整个球体发出明亮的荧光信号，表明 TI-ER NPs 成功浸润。用 635 nm 激光（1 W cm^-2，10 分钟）照射后，完整的球体逐渐塌陷，到第 3 天几乎完全崩解，显示了对缺氧肿瘤的强效光疗活性。相比之下，未经激光照射的 MCTS 保持了结构的完整性，证实了 TI-ER NPs 极佳的生物安全性。

结论

   我们设计并合成了一种近红外-II AIE PS（命名为 TI-ER），用于激活癌细胞的热变性。在激光激发下，TI-ER NPs 能有效产生 I 型 ROS 并诱导强效光热转换。最重要的是，TI-ER NPs 具有精确的 ER 靶向能力，可通过 TI-ER NPs 介导的光疗激活热休克，从而有效清除癌细胞。此外，TI-ER NPs 还具有出色的 MCTSs 穿透能力，在 635 nm激光照射下可有效诱导 MCTSs 分解，这表明 TI-ER NPs 在缺氧的 TME 中具有显著的抗肿瘤潜力。这项工作不仅开发了一种ER靶向I型PS，还推进了基于热渗透的治疗策略。

参考文献

An Endoplasmic Reticulum-Targeted NIR-II Type I AIE Photosensitiser for Triggering Pyroptosis, Xinyu Li, Lijin Yang, Bingbing He, Dongxiu Li, Changqing Lei, Nan Li* and Na Zhao*, Chem. Commun., 2025,61, 16580-16583,https://doi.org/10.1039/D5CC04652A