内容提要
我们开发了Bio-Cy，这是一种前所未有的有机单分子光敏免疫刺激剂，它通过破坏焦亡检查点来刺激自扩增焦亡和cGAS-STING途径，以增强适应性和先天免疫激活。机制研究表明，Bio-Cy可以靶向癌细胞，通过内吞作用转运到溶酶体，通过I型光动力机制产生活性氧，即使在缺氧条件下也能破坏癌细胞。有趣的是，这种溶酶体破坏不仅通过释放Ca2+的线粒体损伤激活适应性免疫的caspase-3/GSDME依赖性焦亡，而且还通过释放线粒体DNA增强cGAS-STING先天免疫途径。更重要的是，最初的溶酶体损伤会损害保护性细胞自噬，破坏焦亡检查点，从而阻止受损线粒体的清除，放大免疫反应，最终促进免疫治疗。
Bio-Cy的设计与合成及其对粘度的光谱响应
经典的半花青碱基荧光染料具有供体-π-受体结构和分子内电荷的特点转移。我们使用Knoevenagel缩合从3,5-二碘-4-羟基苯甲醛和苯并[e]吲哚合成了半花青素荧光团(Cy)，其中乙烯基键作为粘度响应性的分子转子。对于针对肿瘤组织的光动力治疗(PDT)，生物素(一种肿瘤靶向片段)通过酰胺缩合结合形成Bio-Cy。后来，我们证实了生物素化有利于分子激发态电子转移，从而促进I型ROS的产生。因此，Bio-Cy应该表现出粘度响应特性、抗缺氧I型PDT和增强的肿瘤靶向能力;Bio-Cy的合成和结构表征细节如图。为了阐明Bio-Cy的光学性质，我们初步记录了Bio-Cy在不同溶剂中的吸收光谱和荧光发射光谱。对于大多数溶剂，Bio-Cy光谱表现出特征吸收峰，主要在555和585 nm处。值得注意的是，在585 nm激发时，Bio-Cy的荧光明显增强，仅在甘油(Gly)中，在610 nm处最大发射。在其他溶剂中，Bio-Cy发出的荧光可以忽略不计，这表明Bio-Cy具有与溶剂极性无关的粘度响应。为了进一步研究Bio-Cy对粘度变化的敏感性，分析了Bio-Cy在不同的磷酸盐缓冲盐水(PBS)和Gly混合物中的荧光光谱。随着黏度从1.086增加到1145.8 cP, 610 nm处的荧光增强了853倍。此外，在紫外光照射下，溶液发出鲜艳的红色荧光。更重要的是，在2.956-1145.8 cP范围内，Bio-Cy在610 nm处的荧光强度与粘度(Log η)呈强线性相关，线性系数高达0.99，表明Bio-Cy对粘度变化高度敏感。这种粘度响应性主要归因于Bio-Cy的乙烯基键，它的功能是分子转子。在低粘度环境中，乙烯基键的自由旋转促进了退出分子通过非辐射途径的能量耗散，从而淬灭了荧光。相反，随着黏度的增加，这种分子内旋转被抑制，荧光增强。为了研究Bio-Cy黏度响应的特异性，将生物体系中常见的各种金属离子和氨基酸引入溶剂中，监测荧光信号的变化。除了Gly外，其他生物分析物没有改变荧光信号，从而强调Bio-Cy具有高度特异性的粘度响应。此外，测量Bio-Cy在PBS和Gly中的荧光寿命。在PBS和Gly中，Bio-Cy的荧光寿命分别为0.2和1.7 ns，这表明Bio-Cy在体内粘度成像方面具有良好的应用潜力。
光动力反应机制
由于PDT的功效受到PS类型和ROS生成能力的显著影响，因此我们以2，7-二氯二氢荧光素(DCFH)作为通用ROS指示剂，对Cy和Bio-Cy的ROS生成能力进行了实验研究。因为它可以被大多数ROS氧化生成荧光产物2，7-二氯荧光素(DCF)。因此，我们采用DCFH来初步评价化合物在PBS中产生总ROS的能力。从荧光光谱可以看出，在与氙灯相同的照射条件下(585 nm, 5 mW cm−2)，Bio-Cy从DCFH到DCF的转化效率最高，可见其较强的ROS生成能力。值得注意的是，生物素化后，Bio-Cy产生ROS的能力显著增强。暴露135 s后，Bio-Cy的DCF荧光强度不仅是Cy的35倍，而且比广泛使用的商业ps亚甲基蓝(MB)、氯胺e6 (Ce6)和孟加拉玫瑰(RB)分别高1.34倍、3.48倍和24.12倍。为了进一步阐明生物素化ps增强ROS生成的光动力学机制，我们分别使用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)、二氢罗丹明123 (DHR123)和羟基苯基荧光素(HPF)检测1O2、O2•−和•OH。当使用DPBF时，Bio-Cy和Cy的吸光度相对降低，说明Bio-Cy和Cy具有相似的1O2生成能力。但其生成1O2的能力明显弱于RB,1O2的产率分别仅为0.029和0.024。这一发现与总ROS的结果相矛盾，促使我们关注自由基ROS的产生。与不能产生自由基ROS的Ce6、RB等II型ps相比，这表明Bio-Cy可以通过I型光动力学反应机制(电子转移)高效生成O2•−和•OH，这对抗缺氧肿瘤PDT至关重要。这一发现被电子顺磁共振(EPR)光谱进一步证实。这些结果表明，Bio-Cy主要通过I型光动力途径产生自由基ROS。此外，微量的1O2通过II型机制产生。值得注意的是，与简单的II型PS (Cy)相比，Bio-Cy含有一个生物素基团，这增强了I型途径对自由基ROS生成的贡献。由于I型光动力机制涉及通过电子转移途径从周围底物产生自由基ROS，我们推测生物素基团促进了Bio-Cy三重态激发态的电子转移。为了验证这一假设并进一步阐明三重态形成的详细机制，我们利用闪光光解分光光度法测定了Bio-Cy和Cy的三重态激发态(T*)寿命。Bio-Cy和Cy的T*寿命分别为6.24µs和10.28µs。通常，ROS产率与系统间交叉(ISC)效率和三重态寿命呈正相关。这个可以忽略不计的差异结果表明，Bio-Cy的生物素组并没有通过延长三重态的寿命来提高ROS的产量。
Bio-Cy的肿瘤细胞靶向能力和光毒性
基于Bio-Cy独特的光学特性和I型光动力反应机制，我们进一步研究了Bio-Cy在细胞环境中的生物学功能。首先，采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)研究Cy和Bio-Cy在癌细胞中的细胞摄取和细胞内分布。在MCF-7细胞摄取后，Cy主要积聚在内质网(ER)中，ER追踪器的共定位系数为0.81。生物素化后，Bio-Cy在溶酶体内精确定位，共定位系数为0.88，显著高于其他商业细胞器染料。Bio-Cy的靶向作用在MDA-MB-231和4T1细胞系中得到进一步证实。Bio-Cy亚细胞定位的显著改变可能归因于癌细胞膜表面生物素受体的过度表达促进了内吞机制。为了验证这一假设，我们以MCF-7细胞为对象，以37℃下与Bio-Cy共培养的细胞为对照组，进行了一系列合理设计的摄取实验。荧光成像显示，在相同的孵育期，在4°C孵育的细胞中，Bio-Cy的摄取可以忽略不计，这表明Bio-Cy内吞作用依赖于能量，而不是通过被动扩散发生。此外，在生物素或氯丙嗪(一种网格蛋白介导的内吞作用抑制剂)预处理的细胞中，Bio-Cy的细胞内荧光减弱了3 - 5倍。相比之下，制霉菌素(Nys)，一种小窝介导的内吞作用抑制剂，对细胞摄取的影响可以忽略不计。这些发现强烈表明，Bio-Cy通过生物素受体介导的内吞途径靶向细胞内溶酶体，网格蛋白在整个过程中发挥调节作用。然而，由于Cy在细胞内自由扩散，环境变化对其摄取的影响可以忽略不计。两种分子在细胞内的显著不同分布与我们预期的分子设计策略一致。由于生物素受体只在癌细胞的细胞膜上过度表达，Bio-Cy是一种有效的抗癌药物假设固有地靶向癌细胞。为了实证评估Bio-Cy的癌细胞靶向效果，将其分别添加到由MCF-7和NIH/3T3(生物素受体阳性和阴性)细胞组成的共培养中。MCF-7和NIH/3T3细胞(分别用蓝色和黄色方框表示)根据其明显的形态学差异很容易区分。有趣的是，荧光成像证明，Bio-Cy选择性地在MCF-7细胞中积累，而3T3细胞的荧光明显较弱，两种细胞类型之间的差异超过4倍。这些发现表明，生物素组赋予Bio-Cy对高水平生物素受体表达的癌细胞具有特殊的靶向和成像能力，从而为将Bio-Cy精确整合到肿瘤诊断和治疗中提供了潜力。随后，我们研究了Bio-Cy在细胞环境中产生的ROS。Bio-Cy与MCF-7细胞共培养，在光照下诱导ROS指示器DCFH发出强烈荧光，表明Bio-Cy通过PDT有效产生ROS。为了证实Bio-Cy也可以通过细胞内I型光动力反应机制产生自由基ROS，我们分别使用HPF和DHE检测细胞内•OH和O2•−。正如预期的那样，在Bio-Cy照射后，在常氧和缺氧条件下均检测到HPF和DHE荧光信号，这表明Bio-Cy的I型PDT机制也适用于MCF-7细胞。值得注意的是，与I型自由基相关的独特氧循环机制有效地减轻了氧对传统临床PDT的限制。因此，Bio-Cy也显示出克服缺氧PDT挑战的潜力，这对于肿瘤的临床PDT尤其重要，因为肿瘤组织通常存在于缺氧的TME中。此外，利用3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5二苯基溴化四氮唑(MTT)测定法评估了Bio-Cy对各种乳腺癌细胞系(MCF-7、MDA-MB-231和4T1)的光毒性和暗毒性作用。在580 nm LED光照射(40 mW cm−2,5 min,12J cm−2)下，Bio-Cy对所有乳腺肿瘤细胞系都表现出明显的光毒性。值得注意的是，即使在缺氧条件下，MCF-7、MDA-MB-231和4T1细胞系的光致毒性IC50值分别为1.153、1.227和1.251µM。为了阐明Bio-Cy对肿瘤细胞的PDT作用，记录钙素- am /碘化丙啶(PI)染色图像。钙素- am和PI分别选择性染色活细胞和死细胞。单独使用Bio-Cy对癌细胞没有任何细胞毒性作用，钙素- am具有广泛的绿色荧光。然而，光照射后，绿色荧光减弱，几乎完全被PI的红色荧光所取代。这种照射前后的变化表明，在常氧和缺氧条件下，bio - cy生成的ROS都对癌细胞产生了实质性的损伤。
光子驱动的Bio-Cy热亡机制
在证实了Bio-Cy的溶酶体靶向性和对肿瘤细胞有效的PDT作用之后，我们研究了Bio-Cy是否可以通过假设的溶酶体破坏机制激活细胞热凋亡途径，这是光免疫治疗成功的一个关键方面。最初，我们使用吖啶橙(AO)评估溶酶体完整性。在完整溶酶体的酸性环境中，AO是一种质子化的低聚物，发出红色荧光。相反，当溶酶体膜受损，环境酸度降低时，去质子化的AO单体渗漏到细胞质中，发出绿色荧光。在溶酶体内，AO的红色荧光在未经处理和Bio-Cy共培养的MCF-7细胞中都很明显，表明在这一阶段溶酶体膜的完整性得到了保存。然而，在光照下，bio - cy生成的ROS会原位破坏溶酶体膜，损害其完整性，AO迅速泄漏到细胞质中。因此，红色和绿色荧光分别减弱和增强，这与MDA-MB-231和4T1细胞的观察结果一致。为了全面证实溶酶体的破坏，我们使用组织蛋白酶B特异性激活的荧光探针Magic Red进一步验证了组织蛋白酶B从溶酶体渗漏。在非光照组中，Magic Red仅在溶酶体内被激活。与此形成鲜明对比的是，在光照组，Magic Red照亮了整个细胞质，荧光明显增强，提示溶酶体破裂导致组织蛋白酶B渗漏，细胞质内MagicRed被广泛激活。此外，在Bio-Cy诱导溶酶体原位破坏后不久，在癌细胞的明视野显微镜图像中观察到与细胞凋亡相关的显著形态学变化。细胞不是收缩，而是形成大的膜泡，这是一种非常容易让人联想到焦亡的特征。扫描电子显微镜(SEM)图像进一步证实了这种明显的形态变化。为了全面观察整个冒泡过程，使用CLSM记录光照后细胞形态变化的视频(视频S1)。视频显示，在光照射停止后约3分钟，细胞膜表面出现多个小气泡，这远远优于临床使用的化疗药物。到10分钟时，这些小气泡合并成一个更大的气泡，在一个小时的过程中继续膨胀。这些观察结果表明，Bio-Cy具有快速诱导光子驱动的焦死的良好潜力。受这些结果的鼓舞，我们更详细地研究了生物cy诱导光子驱动的焦亡的机制。在细胞内，溶酶体是关键的“钙储存”，在维持钙离子稳态和调节钙信号传导方面起着至关重要的作用。在溶酶体破裂时，大量Ca2+被释放到细胞质中。Fluo-3 AM是一种Ca2+荧光探针，有助于实时监测细胞内Ca2+浓度变化。在Bio-Cy+L组中，Fluo-3 AM荧光在照明后持续增强，证实了大量的Ca2+泄漏。这种细胞质Ca2+激增随后在线粒体中积累，导致线粒体Ca2+过载，最终导致线粒体损伤和功能障碍。为了验证这一假设，我们使用线粒体Ca2+荧光探针Rhod-2 AM来监测线粒体Ca2+浓度的变化，并使用MitoTracker来标记线粒体。在Bio-Cy+L组中，线粒体中只出现Ca2+激活的Rhod-2 AM发出的绿色荧光，这表明溶酶体破裂后释放的Ca2+随后集中在线粒体内。值得注意的是，线粒体形态从丝状转变为类似“甜甜圈”的泡状结构，表明Ca2+超载诱导的线粒体异常。这线粒体膜电位的评估进一步证实了这一现象。在具有正常膜电位的线粒体内，JC-1可以形成j聚集体，诱导红色荧光发射。相反，当膜电位消散时，染料单体分布在线粒体基质内，发出绿色荧光。对照组和bio - cy处理的细胞均只出现红色荧光。相反，氧化磷酸化抑制剂CCCP(阳性对照)和Bio-Cy+L组的细胞质中检测到大量的绿色荧光，表明PDT期间存在大量的线粒体损伤。为了进一步证实线粒体损伤是由溶酶体破裂后Ca2+的释放引起的，我们利用Ca2+螯合剂(BAPTA-AM)来验证这一顺序过程。在没有光照射的情况下，膜电位指示剂罗丹明123表现出明亮的绿色荧光。pdt处理后，这种绿色荧光减弱，证实了JC-1膜的发现之前讨论过的潜在分析。值得注意的是，BAPTA-AM预处理导致在接受光处理的细胞中持续存在显著的荧光信号。这一观察表明，Ca2+螯合剂有效地阻止Ca2+易位，这是释放后溶酶体破裂，进入线粒体，从而减轻线粒体损伤。此外，对亮场图像的分析显示，Ca2+螯合剂的掺入改变了Bio-Cy光诱导细胞死亡的机制。这一过程从具有焦亡特征的膜肿胀和鼓泡转变为具有凋亡特征的细胞凝聚。这一观察结果进一步证实了生物素诱导的溶酶体-线粒体级联损伤在启动热亡中的关键作用。此外，Ca2+过载经常导致mPTP持续开放，促进Cyt C等线粒体内容物的释放，这对于触发焦亡的下游途径至关重要。采用钙黄素- am染料评价mPTP的开放程度。细胞摄取后，钙黄素- am被细胞内酯酶激活，发出绿色荧光。当钙黄素- am与Co2+配合时，其荧光被猝灭。然而，在健康的线粒体中，mPTP保持关闭状态，阻止Co2+进入线粒体。因此，只有绿色荧光出现在线粒体内，只有当mPTP由于Ca2+过载而开放时，荧光才会熄灭。因为它可以诱导大量Ca2+流入细胞并促进线粒体钙超载，所以离子霉素可以作为阳性对照组。在对照组和Bio-Cy组的细胞中同时加入钙黄素- am和CoCl2，仅在线粒体内产生绿色荧光，表明正常癌细胞线粒体中的mPTP仍然是封闭的。相反，在离子霉素和Bio-Cy+L组中，绿色荧光完全猝灭，表明溶酶体破裂释放的Ca2+在线粒体中过度积累，从而使mPTP大幅打开。随后的免疫荧光成像显示，在Bio-Cy+L组中，细胞内Cyt C显著减少，线粒体明显脱位，证实了持续的mPTP开口促进Cyt C从线粒体渗漏的假设。此外，透射电镜(TEM)图像中观察到的线粒体肿胀和嵴丢失提供了额外的证据，支持Bio-Cy光激发诱导溶酶体-线粒体损伤级联途径的假设。目前，有两种主要的下游途径与线粒体损伤诱导的焦亡有关。第一个途径是由caspase-1-GSDMD轴的激活启动的，而第二个途径涉及caspase-3的激活，切割GSDME并随后诱导细胞焦亡。
由于大量的Cyt C，一个关键的caspase-3上游调节因子被释放，我们首先在细胞模型中证实了caspase-3和GSDME的激活。GreenNuccaspase-3检测试剂盒有助于实时监测活细胞中caspase-3的激活情况。该试验利用荧光性GreenNuc caspase-3底物，包括DNA染料和caspase-3特异性识别的DEVD片段。由于含有大量的负电荷，DNA染料不能穿透细胞核;然而，在被激活的caspase-3切割后，染料被释放，使其能够进入细胞核并发出绿色荧光。与其他处理组相比，只有Bio-Cy+L处理组在细胞核内显示出强烈的绿色荧光，表明PDT后caspase-3明显活化。更重要的是，caspase-3抑制剂(Ac-DEVD-CHO)使绿色荧光信号消失，抑制了细胞形态中的焦亡泡。这些明显的形态学变化进一步证实了bio - cy介导的光致焦亡依赖于caspase-3的激活。此外，在PDT后，免疫荧光成像显示GSDME-N聚集在细胞膜表面，这表明caspase-3的激活促进了GSDME裂解成执行焦亡的蛋白GSDME-N，该蛋白随后通过形成膜孔诱导焦亡。此外，乳酸脱氢酶(LDH)的释放进一步证实了焦亡后，膜表面的孔形成可能导致细胞内容物的泄漏，这也为激活ICD提供了必要的条件。为了证明bio - cy诱导的光子驱动热死的快速发生，我们使用western blot分析在PDT后不同时间间隔内细胞中的蛋白表达。值得注意的是，激活的caspase-3和GSDMD-N蛋白早在光照后5分钟就上调了，并且随着时间的推移，它们的表达水平逐渐增加。这些发现与视频中记录的观察结果一致，进一步证实了Bio-Cy在迅速诱导肿瘤细胞焦亡方面的功效。此外，caspase-1和GSDMD的荧光成像和western blot分析证实，焦亡似乎完全由caspase-3-GSDME途径介导，显示它们的蛋白表达没有改变。此外，在PDT后不久，使用膜联蛋白V-FITC/PI染色定量bio - cy诱导的肿瘤细胞热凋亡率。膜联蛋白V-FITC与细胞膜内侧的磷脂丝氨酸特异性结合，发出绿色荧光，PI与膜通透性改变的细胞内的核酸结合，发出红色荧光。在热噬细胞中，膜联蛋白V-FITC/PI可以通过细胞膜上形成的孔进入，从而实现细胞标记。与其他组相比，Bio-Cy+L组肿胀的细胞膜上同时出现膜联蛋白V-FITC荧光，细胞核内同时出现PI荧光。光照15 min后收集细胞进行流式细胞术检测。
结果显示，66.4%的细胞此时已经发生了焦亡。快速有效地启动焦亡，不仅归因于溶酶体破裂后的线粒体损伤级联，还归因于先前假设的细胞保护性自噬机制的抑制，这显著增强了焦亡途径的激活。同时，随着线粒体损伤触发热亡，细胞自主启动线粒体自噬清除机制，促进受损线粒体的清除，从而防止进一步的细胞损伤。LC3蛋白在自噬体的形成和成熟中起关键作用，因此被广泛用作自噬活性标志物在自噬早期，LC3-I通过与磷脂酰乙醇胺结合转化为LC3-II，形成自噬膜。因此，LC3-II积累通常表明自噬体成熟。在LC3 western blot分析中， LC3-I明显在Bio-Cy+L组中几乎完全转化为LC3-II，表明自噬途径激活。然而，由于溶酶体破裂，自噬体不能与溶酶体融合形成自噬体，从而阻碍了最终的降解，p62蛋白上调证实了这一点。作为一种至关重要的自噬受体，p62的表达经常被用来评估自噬通量的活性水平。在正常自噬条件下，p62在自噬酶体内降解;相反，当自噬受到抑制时，p62会积累。整个bio - cy诱导的光子驱动的焦亡机制示意图。在提出的机制中，不仅溶酶体被破坏，激活焦亡，而且细胞的保护机制也被抑制，从而进一步放大焦亡途径的激活。此外，各种细胞死亡抑制剂和相关蛋白标记物，包括铁下垂抑制剂(铁他汀-1、利蒲他汀-1和去铁嘧啶)、自噬抑制剂(3-甲基腺嘌呤)、坏死性下垂抑制剂(坏死性他汀-1)和二硫fidfidptosis抑制剂(TCEP)，被用来研其他细胞死亡途径的潜在参与。这些抑制剂均不能有效减轻bio - cy诱导的光毒性作用，并且未观察到GPX4和P-MLKL表达水平的变化，表明未激活其他细胞死亡途径。
体内肿瘤靶向成像和治疗
在进行体内实验之前，我们使用MCF-7细胞建立了三维肿瘤球模型，并初步评估了Bio-Cy对这些肿瘤球的渗透性和PDT功效。肿瘤球与Bio-Cy共孵育12 h后，用CLSM在不同z轴深度上观察荧光信号。Bio-Cy在肿瘤球的不同z轴平面上都有明显的穿透，特别是在中心区域，表明Bio-Cy具有显著的肿瘤穿透能力。此外，DCFH-DA和Calcein-AM/PI染色成像显示，在光照射下，Bio-Cy在球内的肿瘤细胞中有效产生ROS并诱导细胞毒性，从而显示了Bio-Cy优越的抗缺氧PDT性能，突出了其治疗实体肿瘤的潜力。由于其令人印象深刻的体外抗肿瘤效力，我们使用体内荧光成像来鉴定Bio-Cy在mcf -7肿瘤裸鼠中的肿瘤靶向能力，这对于精确的光子驱动肿瘤细胞焦灭是必不可少的。尾静脉注射Bio-Cy后，肿瘤部位在1小时内发出荧光，2小时后荧光强度达到峰值，荧光持续时间长达8小时。与此形成鲜明对比的是，缺乏生物素修饰的Cy，在注射后8小时内，肿瘤部位没有发出任何显著的荧光。这些明显不同的荧光发射强调了生物素介导的主动肿瘤靶向的优势，从而证明了Bio-Cy在肿瘤靶向荧光成像中的应用潜力。此外，注射后8小时，两组小鼠原代器官的体外图像显示出不同的Cy和Bio-Cy分布模式。Cy主要积聚在肝脏，而Bio-Cy在肿瘤组织中显著富集。值得注意的是，在Bio-Cy组的肿瘤中，荧光强度是Cy组肿瘤的4.9倍，进一步证明Bio-Cy和Cy在体内表现出明显不同的循环途径。然而，Bio-Cy在血液中的长周期循环引起了我们的注意，这种生物分布模式是纳米颗粒进入血液的典型特征。在进行体内成像和治疗时，由于药物浓度要求高，需要尾静脉注射，才能改善为了保证Bio-Cy在水溶液中的溶解度，避免药物沉淀，我们在制备PBS注射剂时加入1%t80(试剂允许含量)作为助溶剂。我们推测这可能与Bio-Cy和t80共组装形成纳米颗粒有关。为了验证Bio-Cy是否能形成纳米颗粒，我们进一步测试了不同成分的注射剂的动态直径。不添加t80时，1 mL注射液(Bio-Cy的10 mM DMSO原液30µL + 970µL PBS)的动态直径为2962 nm，溶液中可以快速观察到药物沉淀聚集。然而，加入共溶剂t80后，1 mL注射(30µL 10mM DMSO Bio-Cy原液+ 960µL PBS+10µL t80)的动态直径为69.47 nm，这意味着加入t80后，溶液中形成了均匀大小的纳米颗粒。当PBS中仅加入t80时，溶液的动态直径为11.73 nm，进一步证实了Bio-Cy与t80共组装的特异性。因此，我们认为Bio-Cy中生物素群固有的肿瘤靶向特性和EPR效应的双重作用。在其体内成像和治疗过程中，形成的纳米颗粒是肿瘤高保留率和Bio-Cy在血液中长循环的主要原因。随后，我们综合评价了Bio-Cy对mcf -7荷瘤裸鼠的抗肿瘤作用。当肿瘤体积达到100 mm3时，将小鼠随机分为PBS、Bio-Cy和Bio-Cy+LPDT。每2天监测肿瘤体积和体重。值得注意的是，经过两次PDT治疗后，Bio-Cy+L组的肿瘤被完全根除，而PBS组和Bio-Cy组的肿瘤迅速生长。此外，在整个治疗期间，所有组的体重变化都可以忽略不计。值得注意的是，Bio-Cy+L组的肿瘤在pdt后第6天缩小几乎消失，在整个实验期间的复发可以忽略不计。在所有小鼠组中，主要器官的苏木精和伊红(H&E)染色显示，与PBS组相比，治疗组的变化可以忽略不计，这表明PDT具有独特的时空激活特性，是一种更安全的治疗方式。综上所述，Bio-Cy通过光激活诱导溶酶体功能障碍，导致肿瘤焦亡，激活cGAS-STING通路，具有强大的抗肿瘤作用。
结论
我们首次开发了具有开创性的肿瘤靶向单分子有机光敏免疫刺激剂Bio-Cy，它具有自扩增焦亡和cGAS-STING途径，从而促进了适应性和先天抗肿瘤免疫的协同激活。本研究通过生物素分子集成靶向基团辅助策略，开发出一种新型I型小有机分子PS，不仅对肿瘤组织具有特异性靶向特性，而且出人意料地通过电子转移途径促进O2•−和•OH的生成，从而有效克服了缺氧肿瘤微环境的局限性。此外，通过其生物素群，Bio-Cy通过受体介导的内吞作用特异性靶向肿瘤细胞内的溶酶体。这种靶向能够通过PDT产生大量ROS，从而严重破坏溶酶体。包括转录组学分析在内的综合生物学实验表明，bio - cy诱导的溶酶体破裂可导致线粒体Ca2+过载，显著诱导caspase-3/ gsdme依赖性细胞焦亡，从而导致广泛的mtDNA释放和随后的激活。cGAS-STING通路同时，溶酶体破坏进一步阻碍了自溶酶体的形成，自溶酶体是焦亡检查点，从而使级联反应永续，增强了适应性和先天免疫反应的协同激活。我们应用Bio-Cy治疗原发性和远端肿瘤，逆转免疫抑制，显著抑制肿瘤生长。通过广泛而细致的研究，首次阐明了溶酶体破裂通过caspase 3/GSDME轴诱导热亡的分子机制及其涉及cGAS-STING通路激活的级联效应。
参考文献
A Photon-Driven Unimolecular Immunostimulant for Self-Amplified Pyroptosis and cGAS-STING Pathway by Destroying the Pyroptosis Checkpoint，Shuang Zeng, Chen Chen, Zhihan Guo, Chunfang Qin, Yang Wang, Xiaosheng Liu, Xin Li, Hyunsun Jeong, Yifu Hao, Danhong Zhou, Saran Long, Zhenyong Wu, Jingyun Wang,* Haidong Li,* Xiaojun Peng,* and Juyoung Yoon，Angew. Chem. Int. Ed. 2025, 64, e202513815，doi.org/10.1002/anie.202513815
