内容提要
我们介绍了两种新型含硒呫吨类光敏剂（NSeMorph和NSeAze）的合成及其光动力治疗作用，它们在650nm以上有吸收，且分子量低于420g/mol。研究表明，NSeMorph和NSeAze对胶质母细胞瘤细胞系（U87MG和U118MG）均有光动力治疗活性，更有趣的是，光敏剂的疗效和选择性因供体侧基的不同而存在显著差异。使用吗啉供体的NSeMorph对U87MG细胞系的IC50值为15.8μM，对U118MG细胞系为8.0μM。令人惊讶的是，在健康细胞系（L929）中，当浓度为20μM时，仍未达到IC50，这表明尽管不存在基于激活的笼状基团或靶向基团，NSeMorph仍具有选择性。当供体单元改为氮杂环丁烷后，U87MG细胞系的IC50值达到456nM，U118MG细胞系达到461nM，它们兼具在水性介质中的近红外吸收和低分子量(<400 g / mol)
结果与讨论
近红外光敏剂的设计与合成
本研究分别选择吗啉和氮杂环丁烷这两个供体侧基来设计光敏剂NSeMorph和NSeAze。在此处，主要目的是观察侧供体是否会在细胞定位和单线态氧量子产率方面产生显著差异，进而在光动力治疗作用中产生关键差异。不过，所观察到的巨大差异是未曾预料到的。通过SwissADME计算确定，这两种结构都具有高生物相容性、类药性，并且符合Lipinski规则，有望穿透血脑屏障。lightBBB工具基于大型数据集，其预测血脑屏障渗透性的准确率达90%，该工具预测NSeAze和NSeMorph都能穿透血脑屏障。亚甲蓝是一种结构相似的化合物，也是已知的中枢神经系统药物，能够穿透血脑屏障。在碘存在下，二苯胺与分子硒和氧化硒反应生成化合物2。用PMB–Cl保护后，在NBS存在下进行溴化，得到二溴衍生物4。与吗啉进行布赫瓦尔德–哈特维希偶联反应生成化合物5，再用分子碘进行氧化脱保护，得到标题化合物。NSeMorph（五步总产率34%）。在NSeAze的合成中，化合物4在钯催化剂存在下与氮杂环丁烷偶联得到化合物6。按照上述相同的氧化脱保护步骤，得到标题化合物NSeAze（五步总产率26%）。
光物理表征
两种光敏剂NSeMorph和NSeAze在PBS缓冲液（pH 7.4，含1% DMSO）中的吸收光谱和发射光谱被记录下来。两种化合物在671 nm处均表现出吸收最大值。事实上，在罗丹明核心上进行的双原子修饰组合产生了理想的加和性质，观察到约120 nm的位移。在核心中使用重原子（硒）的同时实现这一位移，得到了具有低分子量、在近红外区有吸收且具有光毒性潜力的分子。获取了NSeMorph和NSeAze的荧光光谱，其发射最大值分别在717 nm和695 nm处。NSeMorph的荧光量子产率（ΦF）经测定为1.1%。NSeMorph的荧光强度足以通过共聚焦显微镜生成高质量图像。在不同pH值下，曝光10秒后记录吸收光谱，NSeMorph和NSeAze在光照100秒后均未出现明显的光分解现象。随后，在PBS缓冲液中评估了它们的单线态氧生成能力。使用2,2' -（蒽- 9,10 -二基）双（亚甲基）丙二酸作为单线态氧捕获剂，以测定单线态氧生成的量子产率（ΦΔ）。以亚甲蓝为参比（在PBS缓冲液中ΦΔ = 0.52），在含1% DMSO的PBS缓冲液中，计算得出NSeMorph的ΦΔ值为75%，NSeAze的ΦΔ值为31%。值得注意的是，NSeMorph是已报道的在水介质中具有最高单线态氧量子产率的物质之一。此外，还使用单线态氧传感器绿（SOSG）评估了这些光敏剂（PSs）的活性氧（ROS）生成能力。结果发现，NSeMorph和NSeAze在光照下均能产生¹O₂。值得注意的是，与NSeAze相比，NSeMorph使SOSG的荧光强度显著增加，这进一步证明NSeMorph的单线态氧量子产率（75%）高于NSeAze（31%）。此外，使用二氢罗丹明123（DHR123）在PBS（pH 7.4）中评估了光敏剂（PSs）的I型活性氧（ROS）生成能力。除了II型机制外，两种光敏剂还使氧化型DHR123的发射显著增加，这支持通过I型途径生成活性氧。
细胞毒性分析
通过MTT测定法确定了NSeAze和NSeMorph对胶质母细胞瘤细胞的时间和浓度依赖性影响。使用多种已确立的指标对NSeMorph和NSeAze的光动力效力和选择性进行了定量评估，包括光毒性指数（PI）、选择性指数（SI）和体外治疗指数（TI）NSeAze在U87MG和U118MG细胞中表现出较高的光动力效能，PI值分别为144.7和131.0。然而，NSeAze也显示出一定的暗毒性，在U87MG细胞中的IC50值为65.85±2.51μM，在U118MG细胞中为60.4±2.65μM，在健康的L929细胞中为129.4±5.06μM，这表明与NSeMorph相比，其治疗窗口更窄。相比之下，NSeMorph表现出更优异的暗安全性，在U87MG和L929细胞中，浓度高达500μM时也未检测到细胞毒性，在U118MG细胞中仅表现出中等暗毒性。在光激活条件下，NSeMorph在U87MG和U118MG细胞中的PI值经计算分别为>31和46.7。值得注意的是，NSeAze在U87MG（TI=287.6）和U118MG（TI=281.1）细胞中的体外治疗指数（TI）最高，不过这部分是由于其光毒性IC50较低。NSeMorph表现出更显著的暗安全边际，特别是在L929细胞中（针对U118MG细胞，TI>62.3）。选择性指数（SI）值反映了在光照条件下肿瘤与正常细胞的区分度相当。综上，这些研究结果表明，虽然NSeAze具有更高的内在光毒性效能，但NSeMorph由于其极低的暗毒性，可能具有更安全的光治疗特性。
细胞摄取与内化
我们在胶质母细胞瘤细胞系（U87MG和U118MG）以及非恶性成纤维细胞系（L929）中，对NSeAze和NSeMorph的细胞摄取效率进行了定量评估。与NSeMorph相比，NSeAze在所有测试的细胞类型中均表现出显著更高的内化水平，且具有明确的肿瘤选择性特征。在U87MG和U118MG细胞中，NSeAze的摄取率均超过34%-38%，而在L929细胞中，其摄取率则较低（约22%），这表明它在神经胶质瘤细胞中优先积累。相比之下，NSeMorph在所有细胞系中的摄取率始终极低（<2%），这表明其内化机制亲和力低或效率低，同时细胞死亡率也较低。我们认为，细胞摄取率的巨大差异主要与这两种物质的分配系数存在显著差异有关。值得注意的是，尽管与NSeAze相比，NSeMorph多了四个CH2基团，但NSeMorph中额外氧原子的存在使其水溶性显著提高，推测这是通过充当氢键受体实现的。在细胞摄取分析之后，通过时间依赖性活细胞共聚焦显微镜在U87MG和U118MG胶质母细胞瘤细胞中研究了NSeAze和NSeMorph的细胞内运输动态和亚细胞器靶向性，以观察溶酶体和线粒体区室。两种化合物均以2.5μM的浓度给药，并在孵育后0.5、1、2和4小时进行观察。共定位模式使用皮尔逊相关系数（PCC）进行量化，该系数源自红色通道（PS）与相应绿色细胞器标记之间的荧光强度散点图。共聚焦图像显示，NSeMorph在U87MG和U118MG细胞中表现出动态再分布特征。在早期阶段（0.5-1小时），可观察到与线粒体的部分共定位（U87MG和U118MG中的PCC分别为0.78和0.81）。尽管如此，这种关联随着时间的推移而减弱（U118MG在4小时时的PCC=0.69），表明线粒体定位是短暂的。相比之下，溶酶体共定位更稳定且一致，在各个时间点的PCC值范围为0.75至0.82，表明存在优先的溶酶体定位。这些发现可能是溶酶体趋向性积累的指标，这一特征通常与NSeMorph通过内吞作用内化，随后发生内体成熟有关。然而，NSeAze显示出更持久的线粒体关联。与线粒体的共定位迅速增加，在两种细胞系中于1-2小时达到0.84-0.89的峰值PCC值，此后保持较高水平。也可检测到溶酶体共定位（PCC约为0.79-0.84），但明显次于线粒体富集。随着时间的推移，NSeMorph在溶酶体中逐渐且显著地积累，同时仅具有中等程度的线粒体靶向性，这限制了其通过直接产生线粒体活性氧（ROS）有效诱导细胞死亡的能力。相反，NSeAze在处理后的第一个小时内就能实现快速且高效的线粒体定位，同时也具有显著的溶酶体定位。这种双相分布——以早期线粒体存在随后延迟的溶酶体捕获为特征——可能使NSeAze能够通过线粒体氧化应激以及可能的溶酶体破坏来发挥光毒性作用。为了排除由于溶酶体的酸性环境导致降解的可能性，在黑暗和光照条件下，于不同pH值环境中对NSeMorph和NSeAze的稳定性进行了评估。结果表明，这两种物质在所有条件下均保持稳定。为了阐明线粒体或溶酶体定位依赖的细胞死亡机制，我们进行了进一步分析。为此，我们评估了脂质过氧化（活性氧介导的细胞损伤的主要终产物）。结果表明，NSeAze在光照后立即导致脂质过氧化显著增加，在照射后的静息期进一步加剧，并且在两种细胞系中24小时内均保持升高，U118MG细胞为245.24±5.92%，U87MG细胞为309.64±13.20%。NSeMorph也诱导脂质过氧化显著增加（U118MG细胞为244.22±2.38%；U87MG细胞为216.73±3.98%）；然而，与NSeAze相比，这种作用需要显著更高的浓度（10–15μM）。此外，与NSeAze所观察到的情况不同，脂质过氧化的显著升高主要出现在24小时静息阶段，而非光照后立即出现。脂质过氧化的明显增加解释了细胞的膜结构（如线粒体、溶酶体和质膜）的损伤。细胞游离不饱和脂质含量的检测进一步证实了这一点，这些脂质是在膜结构被破坏时释放出来的。在这方面，磺基磷香草醛测定表明，两种化合物均诱导脂质产物的显著释放，其中NSeAze处理的细胞中增加尤为显著。
ROS检测与分析
通过使用DCFH-DA和DHR123探针的活细胞共聚焦成像，结合活性氧（ROS）清除剂，研究了NSeAze和NSeMorph的细胞内ROS诱导潜力，以阐明所涉及的主要活性物种。用每种化合物的IC50浓度处理U87MG和U118MG胶质母细胞瘤细胞，并在存在或不存在清除剂的情况下进行光照射。在主要检测一般ROS的基于DCFH-DA的测定中，两种光敏剂在光激活后均产生强烈的绿色荧光信号，表明显著的细胞内ROS生成。清除剂联合处理为ROS物种的类型和来源提供了关键的机制见解。单线态氧（1O2）淬灭剂NaN3显著降低了两种NSeAze处理的细胞系中的DCF荧光，在U87MG细胞中观察到的抑制作用比U118MG细胞更完全。同样，基于硫醇的ROS淬灭剂NAC导致两种细胞系中的荧光强度显著降低，证实了过氧自由基和氢过氧化物自由基对总ROS库的贡献。这一观察结果强烈表明，NSeAze能够在两种细胞系中产生混合的ROS谱（I型和II型），其中II型自由基占优势，且这似乎具有细胞类型依赖性。此外，组氨酸可中和单线态氧并部分清除羟基自由基，它也降低了U87MG细胞中的DCF信号，尽管程度比NaN3小。相比之下，羟基自由基清除剂甘露醇和超氧化物及铁螯合抗氧化剂钛铁试剂在两种细胞系中仅具有轻微的抑制作用，表明羟基和超氧化物自由基不是DCF检测到的ROS群体中的主要贡献者。在NSeMorph处理的细胞中获得了类似的结果，其中NAC和NaN3对荧光的抑制作用最强。然而，与NSeAze处理的细胞不同，U87MG和U118MG细胞系均表现出相似的抑制程度。为了专门研究线粒体氧化应激，我们使用DHR123进行了活细胞成像。DHR123在线粒体中被超氧化物氧化后会发出荧光，从而为I型光动力效应提供细胞器特异性的见解。这两种化合物在光照下均能诱导明显的DHR123荧光。值得注意的是，在两种细胞系中，NAC和NaN3都显著减弱了这一信号，证实了线粒体超氧化物的参与。Trolox还降低了经NSeMorph处理的细胞中的DHR123荧光，这支持了过氧自由基和其他 redox活性物质的存在。
结论
本研究展示了两种新型含硒呫吨类光敏剂NSeMorph和NSeAze的设计、合成及光动力疗效，这两种光敏剂是专门为胶质母细胞瘤治疗量身定制的。这些化合物在实现650nm以上吸收的同时，将分子量控制在420g/mol以下，解决了脑癌光动力疗法中一个长期存在的局限，即近红外激活与血脑屏障渗透性之间的权衡问题。两种化合物对胶质母细胞瘤细胞系（U87和U118）均表现出显著的光毒性，但其选择性和效力因供体侧基的性质而存在显著差异。NSeMorph含有吗啉供体，在光激活下表现出中等细胞毒性，对癌细胞的选择性明显高于健康细胞（L929），尽管其不含靶向配体或可激活的笼状部分。这一观察结果表明，供体基团引起的物理化学变化可能会增强被动选择性，这可能是通过摄取或亚细胞定位的差异实现的。带有氮杂环丁烷供体的NSeAze表现出显著增强的效力，对U87MG细胞系的IC50值为456 nM，对U118MG细胞系的IC50值为461 nM。
参考文献
Drastic Impact of Donor Substituents on Xanthenes in the PDT of Glioblastoma, O. Karaman, E. Yesilcimen, M. Forough, Z. Elmazoglu, and G. Gunbas, JACS Au， https://doi.org/10.1021/jacsau.5c00738
