内容提要
本研究设计了酸屏蔽半胱氨酸- peg - dspe (DA-Cys-PD)和pe -卟啉- peg - cbt (Por-CBT)。DA-Cys-PD锚定在肿瘤细胞膜上后，细胞的弱酸性环境使锚定物脱屏蔽生成Cys-PD, Cys-PD随后与Por-CBT发生连锁反应生成具有“疏水-亲水-疏水”结构的Por-Luc-PD。这种原位形成的结构显著地增强了细胞的稳定性卟啉的摄取及其对乳腺肿瘤的光动力治疗作用。在细胞膜锚定的咔嗒反应的帮助下，癌细胞或乳腺肿瘤中的卟啉摄取大致增加，分别是阴性对照组的7.8倍或3.9倍。卟啉摄取的增强导致了对乳腺肿瘤的高效光动力治疗，与阴性对照组的5.5%相比，肿瘤生长抑制率达到了显著的64.1%。
结果与讨
化合物合成如图所示。首先测量DA-Cys-PD和SA-Cys-PD的临界胶束浓度(cmc)，为后续研究建立合适的工作浓度。在含有1%二甲基亚砜(DMSO)的磷酸盐缓冲盐水(PBS, pH 7.4)中，通过透射率测量法测得DA-Cys-PD和SA-Cys-PD的CMC值分别为6.92和5.66 μM。因此，体外实验选择10 μM(略高于两种CMC值的浓度)，以确保两种化合物在应用条件下主要以自组装纳米级聚集体的形式存在。然后表征了SA-Cys-PD和DA-Cys-PD的物理性质。透射电镜(TEM)显示，在PBS (pH 7.4)溶液中，SA-Cys-PD和DA-Cys-PD在10 μM下形成均匀的球形囊泡，平均直径分别为83.1±7.6 nm和67.2±3.6 nm。动态光散射(DLS)结果显示，它们的水动力尺寸分别为233.3±51.3 nm和160.2±35.3 nm。此外，时间过程DLS分析显示，在pH 7.4条件下，酸反应性DA-Cys-PD囊泡在24小时内保持一致的大小(约200 nm)，表明在该pH条件下具有很高的稳定性。然而，在pH 6.8时，囊泡大小逐渐增大，在4 h后达到563.6 nm的最大值，并在24 h内保持稳定，证实了酸触发DA-Cys-PD的转化。这种显著的DLS大小变化可归因于酸触发DA保护基团的去除，从而暴露了半胱氨酸残基。在酸性条件下，半胱氨酸残基的氨基被质子化成- nh3 +，增加了表面电荷密度，增强了静电斥力。这导致扩散层增厚，流体动力半径扩大。此外，去除疏水和空间体积庞大的DA基团增强了表面亲水性，促进了与水的更强氢键，并诱导相邻PEG链的构象从部分折叠状态转变为完全伸展状态。这些因素共同促成了观察到的囊泡DLS大小的增加。在两种pH条件下，酸惰性SA-Cys-PD囊泡的大小没有明显变化。TEM研究进一步证实了这些发现:在pH 7.4时，DA-Cys-PD囊泡表现为定义明确的纳米颗粒，平均直径为80.3 nm，而在pH 6.8时，它们表现出明显的尺寸增加和边界模糊，表明结构膨胀。值得注意的是，与pH 6.8的port - cbt孵育后，DA-Cys-PD囊泡恢复了清晰的形态，平均大小为73.6 nm，与纯click产品pour - luc - pd相匹配。这证实了DA-Cys-之间的酸激活点击反应PD和Por-CBT。相比之下，SA-Cys-PD囊泡在两种pH条件下都保持了原来的形态，并且在pH为6.8的Por-CBT中孵育后没有表现出Por-Luc-PD的结构特征，表明没有活化。此外，通过高效液相色谱(HPLC)监测的DA-Cys-PD和Por-CBT之间pH激活的点击反应的pH依赖动力学分析证实，该反应的激活受pH阈值~ 6.8的控制，与肿瘤微环境的弱酸性相匹配。
首次验证了DA-Cys-PD/SA-Cys-PD的细胞膜锚定行为。由于它们的膜锚定能力主要归功于1,2-二硬脂酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)片段，我们用Cy5修饰该片段以生成Cy5- pd，这是DA-Cys-PD/SA-Cys-PD的模拟物，用于直接监测膜锚定行为。4T1细胞与10 μM Cy5- pd孵育不同时间后，通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)记录Cy5荧光信号。在Cy5- pd处理的细胞中，Cy5荧光在24 h内主要定位在细胞膜上，并与DiI(一种广泛使用的膜指示剂)表现出良好的共定位。这些结果证实了基于dspe - peg的化合物(DA-Cys-PD/SA-Cys-PD)可以在肿瘤细胞膜上有效稳定地锚定至少24小时，这对于后续原位CBT-Cys点击反应的实现至关重要。根据初步的细胞摄取测定，选择10 μM (Por或Por-CBT)的最佳卟啉浓度和2h的DA-Cys-PD或SA-Cys-PD锚定时间进行进一步的实验。接下来，我们研究了CBT-Cys点击反应是否能促进卟啉的细胞膜渗透。具体来说，将4T1细胞用10 μM DA-Cys-PD或10 μM SA-Cys-PD预孵育2小时，然后用10 μM Por-CBT孵育4小时(即“G5: DA-Cys-PD + Por-CBT”和“G4: SA-Cys-PD + Por-CBT”组)。同时，将4T1细胞在添加10%胎牛血清(即“G1: PBS”组)、10 μM卟啉(即“G2: Por”组)或10 μM Por-CBT(即“G3: Por-CBT”组)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中以0.1% PBS (v/v)直接孵育4小时作为对照组。如图共聚焦显微镜细胞图像所示，“G5: DA-Cys-PD + Por-CBT”组的4T1细胞显示出最强的卟啉红色荧光信号，表明细胞内化效率最高。相比之下，“G4: SA-Cys-PD + Por-CBT”或其他对照组的细胞均显示出非常弱的卟啉荧光信号。定量上，“G5: DA-Cys-PD + Por-CBT”组的平均卟啉荧光强度分别是“G2: Por”组、“G3: Por-CBT”组和“G4: SA-Cys-PD + Por-CBT”对照组的9.1倍、6.8倍和7.8倍。这些4T1细胞的流式细胞术分析与共聚焦显微镜成像结果一致。为了验证PD-Luc-Por在细胞膜上的形成，我们使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析了细胞膜成分。质谱显示存在点击产物PD-Luc-Por(计算MS:[M +H]+:3121.2089;实验组(DA-Cys-PD + Por-CBT)观察到MS: m/z 3121.7471，阴性对照组(SA-Cys-PD + Por-CBT)无MS。这一结果证实了酸性在细胞膜上激活了PD-Luc-Por的原位形成。使用MALDI-TOF MS对“G5: DA-Cys-PD + Por-CBT”组的细胞裂解物进行进一步分析，证实了Por-Luc-PD的存在，该产物完全通过CBT-Cys点击反应产生。上述结果证明了细胞膜锚定策略和随后的原位CBT-Cys点击反应在促进卟啉偶联物细胞内化中的重要性。我们假设“G5: DA-Cys-PD + Por-CBT”组的摄取改善归因于产品Por-Luc-PD的“疏水-亲水-疏水”结构。为了进一步证实这一点，我们使用Cy5荧光比较了两种dspe - peg修饰的Cy5结构的细胞摄取效率。其中，亲水磺化Cy5修饰的DSPE-PEG (DSPE-PEG- su -Cy5)被指定为疏水-亲水结构，疏水Cy5修饰的DSPE-PEG (DSPE-PEG-Cy5)被指定为疏水-亲水-疏水结构。
我们探索了我们的策略是否可以增强PDT对乳腺癌细胞的治疗效果。简单地说，4T1细胞首先用0.1% PBS (v/v)在含有10% FBS、20 μM SA-Cys-PD或20 μM DA-Cys-PD的DMEM培养基中孵育2小时。PBS洗涤后，细胞用0.1% PBS、Por或Por-CBT孵育在不同浓度的培养基中再培养4小时，然后在20 mWcm−2下进行激光照射1分钟，然后用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)进行细胞活力测定。在没有激光照射的情况下，即使浓度高达40 μM，所有化合物(SA-Cys-PD、DA-Cys-PD、Por和Por-CBT)对4T1细胞也没有可检测到的细胞毒性。相比之下，在激光照射(20 mWcm−2，1 min)下，细胞活力随着Por或Por-CBT浓度(从5 μM到20 μM)的增加而下降。在20 μM下，实验“G5: DA-Cys-PD + Por-CBT + Laser”组的细胞存活率最低，为41.3%。这明显低于“G2: Por + Laser”组(72.0%)、“G3: Por-CBT + Laser”组(63.3%)、“G4: SA-Cys-PD + Por-CBT + Laser”组(62.1%)。我们还使用MTT法进行了随时间变化的细胞活力研究。结果显示，实验组(G5: DA-Cys-PD + Por-CBT + Laser)细胞活力随时间逐渐降低，且各时间点细胞活力均显著低于所有对照组(G2和G4)。特别是，在pdt后24 h, G5组的细胞活力(21.3%)明显低于对照组(G2: 59.0%， G3: 63.6%， G4: 58.1%)。这些结果表明我们的ph活化膜锚定点击策略具有优越的PDT效果，钙黄素- am /碘化丙啶(PI)双染色结果进一步证实了这一点。然后，我们以，7 ' -二氯二氢荧光素(DCFH-DA)为指标，通过分析各组上述细胞的细胞内ROS水平，验证了PDT效应。不出所料，“G5: DA-Cys-PD + Por-CBT + Laser”组细胞绿色荧光信号最强，表明细胞ROS水平最高。相比之下，所有4个对照组的细胞显示的绿色荧光信号要弱得多。定量分析，“G5: DA-Cys-PD + Por-CBT + Laser”组细胞ROS水平分别是“G1: PBS”、“G2: Por + Laser”、“G3: Por-CBT + Laser”、“G4: SA-Cys-PD + Por-CBT + Laser”对照组的6.8倍、6.2倍、6.2倍、6.1倍。此外，我们使用CLSM进行了共定位研究，以阐明点击产生的共轭物(Por-Luc-PD)的亚细胞分布。4T1细胞被置于与细胞摄取研究相同的实验组。处理后，细胞用Hoechst 33342(蓝色)和MitoTracker(绿色)染色，分别标记细胞核和线粒体。如图所示，在实验“G5: DA-Cys-PD + Por-CBT + Laser”组中，卟啉的红色荧光与MitoTracker的绿色荧光之间存在良好的共定位信号，表明点击产生的偶联物(Por-Luc-PD)的线粒体优先积累。这一结果表明，内化的Por-Luc-PD优先定位于线粒体，这是ROS产生的主要位点，导致ROS产生增强，从而导致PDT疗效。
鉴于卟啉可以在光激发下产生荧光和光声信号，我们验证了我们的策略是否可以通过使用荧光和光声成像。小鼠皮下接种后，4T1肿瘤生长超过7天，体积达到50−100 mm3。然后，将小鼠随机分为5组:(1)“G1: PBS”组，小鼠先静脉注射PBS, 2 h后瘤内注射PBS;(2)“G2: Por”组，先静脉注射PBS, 2 h后再静脉注射0.25 mg/mL Por;(3)“G3: Por-CBT”组，小鼠先静脉注射PBS, 2 h后再静脉注射0.3 mg/mL Por-CBT;(4)“G4: SA-Cys-PD + Por-CBT”组，小鼠先静脉注射0.8 mg/kg SA-Cys-PD, 2 h后再静脉注射0.3 mg/mL Por-CBT;(5)“G5: DA-Cys-PD + Por-CBT”组，小鼠先静脉注射0.8 mg/ kg DA-Cys-PD, 2 h后再静脉注射0.3 mg/mL Por-CBT。之后，各组小鼠分别在2、4、8和24 h进行荧光和光声成像。值得注意的是，对照组(G1−G4)组肿瘤表现出较弱的荧光和光声信号，而我们的实验G5组肿瘤表现出最强的荧光和光声信号，随时间增加，在8 h达到峰值;并且即使在24小时后仍可检测到。定量上，8 h时G5肿瘤部位内的平均卟啉荧光强度分别为对照组G1、G2、G3或G4的7.9倍、2.8倍、2.0倍或3.9倍。值得注意的是，尽管以相似剂量注射了卟啉衍生物，但G2 - G5组显示出不同的荧光强度，这归因于卟啉分子的不同命运，这取决于膜锚定酸激活的咔哒反应是否发生。在G5组(DA-Cys-PD + Por-CBT)中，预锚定的DA-Cys-PD在酸性肿瘤微环境中活化形成Cys-PD, Cys-PD与注射的Por-CBT发生CBT-Cys点击反应生成膜定位的Por-Luc-PD。由于其独特的疏水-亲水-疏水结构，该偶联物在癌细胞中表现出显著增强的细胞内化和延长的滞留时间。相比之下，在对照组(G2−G4)中，注射的Por或Por-CBT缺乏这种锚定/内化机制:这些分子大多留在细胞外，容易被肿瘤快速清除或扩散，导致荧光更弱且短暂。
我们在皮下4T1荷瘤Balb/c小鼠模型中探索了我们的策略增强的PDT效率。实验时间表如图所示。小鼠皮下接种后，肿瘤生长超过7天，体积达到50−100 mm3。然后，将小鼠随机分为5组:(1)“G1: PBS”组，小鼠先静脉注射PBS, 2 h后瘤内注射PBS;(2)“G2: Por +激光”组，先静脉注射PBS, 2 h后再静脉注射3.0 mg/kg Por;(3)“G3: Por-CBT +激光”组，小鼠先静脉注射PBS, 2 h后再静脉注射3.6 mg/kg Por-CBT;(4)“G4: SA-Cys-PD + Por-CBT +激光”组，小鼠先静脉注射3.0 mg/kg SA-Cys-PD, 2 h后再静脉注射3.6 mg/kg Por-CBT;(5)“G5: DA-Cys-PD + Por-CBT +激光”组，小鼠先静脉注射3.0 mg/kg DA-Cys-PD, 2 h后再静脉注射3.6 mg/kg Por-CBT。之后，除G1: PBS组外，其余各组小鼠肿瘤于8 h后接受激光照射(660 nm, 150 mW/cm2，10 min)。这些注射和照射治疗每3天重复一次，共4次(第0天、第3天、第6天、第9天)，每2天监测这些小鼠的肿瘤大小和体重，持续20天。正如预期的那样，G5组的相对肿瘤体积曲线显示出对肿瘤生长的显著抑制效率。第20天，采用标准公式计算肿瘤抑制率:肿瘤生长抑制率(%)=[1−(实验组平均肿瘤体积/ PBS对照组平均肿瘤体积)]×100。计算出G5组的肿瘤抑制率为64.1%，分别显著高于对照组G1(0%)、G2(13.2%)、G3(6.7%)、G4(5.5%)。在20天的治疗过程中，所有组的体重均未发生明显变化，这意味着上述肿瘤差异并非归因于小鼠整体健康状况的变化。在第20天，我们还对各组小鼠进行了拍照。可以清楚地观察到，G5组的肿瘤比其他4个对照组小得多。然后我们将小鼠处死并切除肿瘤拍照。G5组的平均肿瘤重量(0.5 g)明显小于对照组G1 (1.4 g)、G2 (1.1 g)、G3 (1.2 g)或G4 (1.3 g)(。值得注意的是，作为G5的关键对照，G4几乎没有表现出肿瘤生长抑制作用，这是因为肿瘤酸性微环境无法激活SA-Cys-PD触发膜锚固的CBT-Cys点击反应，从而导致卟啉偶联物摄取不足。此外，我们通过流式细胞术使用荧光探针DCFH-DA定量评估肿瘤组织中的ROS水平。如所示，实验组(G5: DA-Cys-PD + Por-CBT + Laser)肿瘤中的ROS水平显著高于所有对照组(G1−G4)，这可能是由于我们的策略显著增强了细胞对卟啉的摄取，从而导致了更好的PDT结果。
结论
本研究提出了一种增强卟啉细胞摄取的细胞膜锚定点击反应策略，实现了对乳腺肿瘤的高效光动力治疗。为此，我们合理设计了酸响应型半胱氨酸- peg - dspe (DA-Cys-PD)和pe -卟啉- peg - cbt (Por-CBT)两种组分。DA-Cys-PD锚定在癌细胞细胞膜上后，弱酸性肿瘤微环境触发其脱屏蔽生成Cys-PD。随后，Cys-PD与相邻的Por-CBT快速发生CBT-Cys点击反应，在细胞膜上生成Por-Luc-PD，其结构为“疏水-亲水-疏水”。我们发现，这种独特的结构可以通过巨噬细胞作用和随后的lmp触发的增强溶酶体逃逸来促进细胞对卟啉有效载荷的摄取。值得注意的是，Por-Luc-PD的“疏水-亲水-疏水”结构对其穿膜至关重要。侧翼的双疏水段有助于稳定插入脂质双分子层，而中央的亲水间隔段则保持相容性。重要的是，这种独特的结构使水介质中的动态折叠和疏水膜界面的展开成为可能。这种行为主要通过能量依赖途径促进膜的直接渗透，特别是巨噬细胞作用。因此，Por-Luc-PD有效地进入细胞，增强溶酶体膜的通透性，促进药物逃逸到细胞质中，促进细胞内药物传递。随后，在激光照射下，它促进了细胞中ROS的产生，大大提高了PDT对乳腺肿瘤的治疗效率。值得注意的是，与使用无酸活性Cys变体SA-Cys-PD的阴性对照组相比，细胞膜锚定的点击反应使4T1癌细胞或肿瘤的卟啉摄取分别增加了约7.8倍或3.9倍。增强的卟啉摄取导致了高效的光动力治疗。我们的研究结果显示，实验组的肿瘤生长抑制率为64.1%，而阴性对照组仅为5.5%。此外，我们的策略还显示出优越的肿瘤蓄积和保留能力，以及良好的生物相容性和生物安全性。
参考文献
Cell Membrane-Anchored Click Reaction Enhances Porphyrin Uptake for Highly Efficient Photodynamic Therapy of Breast Tumors， Yu Ma, Xiaoyang Liu, Qiaochu Jiang, Hai-Dong Xu, Guowei Liang, Wenjun Zhan,* Xianbao Sun,* and Gaolin Liang*， J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 41657−41667，https://doi.org/10.1021/jacs.5c13182
